沙蔥多糖對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞免疫功能的影響及其相關(guān)機(jī)制.pdf

1、天然植物多糖具有多方面的生物學(xué)活性，它對(duì)機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)、細(xì)胞與細(xì)胞識(shí)別和細(xì)胞間物質(zhì)的運(yùn)輸?shù)确矫婢l(fā)揮著重要作用，并對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞沒有毒副作用，有可能成為理想的抗生素替代品。沙蔥（Allium mongolicum Regel）是一種生長(zhǎng)在內(nèi)蒙古草原上量大且羊喜食的優(yōu)質(zhì)牧草，沙蔥多糖是沙蔥的主要活性成分之一，目前對(duì)于沙蔥多糖對(duì)機(jī)體免疫功能的影響已有初步了解，但其免疫作用機(jī)制尚不明確。
　　本研究通過改進(jìn)傳統(tǒng)的梯度密度離心的方法，對(duì)

2、抗凝全血進(jìn)行預(yù)離心，在體外成功分離培養(yǎng)出綿羊外周血淋巴細(xì)胞，并用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)其表面標(biāo)志進(jìn)行了檢測(cè)。將不同濃度（50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL）沙蔥多糖作用于體外培養(yǎng)的綿羊外周血淋巴細(xì)胞，分別用 MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)沙蔥多糖對(duì)細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期的影響；用放射免疫分析法檢測(cè)不同濃度沙蔥多糖于不同作用時(shí)間點(diǎn)（12 h、24 h、48 h、72 h）對(duì)淋巴細(xì)胞分泌 IL-2、IL-4

3、、IFN-γ與 STAT1的影響；同時(shí)，以β-actin為內(nèi)參，用 RT-PCR方法檢測(cè)沙蔥多糖對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4、IFN-γ及 STAT1 mRNA表達(dá)的影響；并檢測(cè)沙蔥多糖對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞 Ca2＋、NO與 iNOS、cAMP與 cGMP含量及其比值的影響；以期為沙蔥多糖的免疫機(jī)制研究提供參考。
　　結(jié)果表明，沙蔥多糖作用持續(xù)48 h時(shí)對(duì)淋巴細(xì)胞周期中的G1與G2期兩個(gè)檢驗(yàn)點(diǎn)均有抑制作用，表明在這兩個(gè)檢

4、驗(yàn)點(diǎn)上抑制了淋巴細(xì)胞增殖；放射免疫分析法檢測(cè)綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4、IFN-γ與STAT1的含量后發(fā)現(xiàn)，不同濃度的沙蔥多糖對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IL-4、IFN-γ及STAT1在不同作用時(shí)間點(diǎn)均有一定程度的促進(jìn)作用，其中沙蔥多糖持續(xù)作用48 h，濃度為250μg/mL時(shí)IL-2的分泌量最高；持續(xù)24 h，100μg/mL時(shí)IL-4與IFN-γ的分泌量最高；持續(xù)12 h，100μg/mL時(shí)STAT1的分泌量最高；

5、RT-PCR結(jié)果顯示，在體外培養(yǎng)綿羊外周血淋巴細(xì)胞中能夠成功擴(kuò)增出內(nèi)參基因(β-actin)和目的基因（IL-2、IL-4、IFN-γ及STAT1），目的基因經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析后確定擴(kuò)增出的目的基因?yàn)榫d羊?qū)倩?，為后續(xù)試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)；不同濃度的沙蔥多糖作用體外培養(yǎng)的綿羊外周血淋巴細(xì)胞，于不同持續(xù)時(shí)間點(diǎn)提取細(xì)胞總RNA，以β-actin為內(nèi)參等量擴(kuò)增目的基因后發(fā)現(xiàn)，沙蔥多糖對(duì)目的基因mRNA的表達(dá)均呈促進(jìn)作用，并成一定的正量效關(guān)系。在沙蔥多

6、糖對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞相關(guān)信號(hào)分子生成的研究中發(fā)現(xiàn)，較高劑量的沙蔥多糖可顯著提高綿羊外周血淋巴細(xì)胞鈣離子濃度，促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞生成NO，并提高iNOS活性，且均在沙蔥多糖濃度為250μg/mL時(shí)Ca2＋與NO含量及iNOS活性達(dá)到最高；此外，沙蔥多糖持續(xù)作用3 h時(shí)，隨著沙蔥多糖濃度的升高，cAMP與cGMP水平呈下降趨勢(shì)，其比值變化無規(guī)律；作用持續(xù)6 h時(shí)， cAMP與cGMP水平變化無規(guī)律，但其比值與3 h相比有下降趨勢(shì)；作用持續(xù)