骨髓間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)節(jié)作用及其對GVHD影響的機制探討.pdf

1、移植物抗宿主病(gragt-vcrsus-host disease,GVHD)是異基因造血干細胞移植的主要并發(fā)癥。供者T淋巴細胞識別宿主抗原提呈細胞攜帶異基因抗原片斷，進一步活化并且分泌大量細胞因子，從而造成宿主的組織損傷。雖然許多標準的GVHD預防方案已經(jīng)廣泛應用于異基因造血干細胞移植術后，但重度的GVHD，尤其是激素難治型GVHD仍然嚴重威脅患者的生命。 aGVHD發(fā)生中的效應階段包括體液免疫和細胞免疫兩方面，即活化的T淋

2、巴細胞釋放大量的炎癥因子，如TNF-α、IL-1等，同時自然殺傷細胞和細胞毒性淋巴細胞產(chǎn)生的細胞毒作用，兩者共同作用造成了宿主的組織損傷。I型T淋巴細胞分泌細胞因子如IL-2，IFNγ,這些炎癥因子促使單核巨噬細胞活化，對炎癥的形成起重要的作用，這些作用可以被Ⅱ型T細胞所分泌的免疫負調(diào)節(jié)細胞因子IL-4和IL-10所抑制。aGVHD的發(fā)生主要是以I型T淋巴細胞產(chǎn)生的強烈的免疫反應，減少Ⅰ型T細胞的產(chǎn)生，增加Ⅱ型T細胞的比例，可以減低GV

3、HD所導致的移植相關死亡率?；罨腡淋巴細胞的遷移在GVHD發(fā)病機制中起了至關重要的作用，這依賴于趨化因子和趨化因子受體之間的相互作用。CXCR3特異性地表達于Thl細胞表面，它的表達增高常出現(xiàn)于aGVHD的早期，并在GVHD發(fā)生過程中促使T細胞到達炎癥部位，進而造成炎性損傷。骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是骨髓造血微環(huán)境的重要組成成分，在體外適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下，具有向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細

4、胞、肌細胞、肌腱細胞等中胚層組織分化的能力。此外，MSCs最引人注目的特點是具有免疫逃逸和免疫負調(diào)節(jié)作用。體外實驗中，MSCs可以抑制由同種異體抗原及有絲分裂原所誘導的T淋巴細胞增殖的作用。器官移植時共輸注MSCs可減輕排斥反應和延長移植物生存時間。造血干細胞移植中輸注MSCs可以預防和治療GVHD。父代—子代半相合骨髓移植作為人類aGVHD動物模型，已經(jīng)被廣泛運用于研究GVHD發(fā)生過程中的免疫學改變。它為人們提供了GVHD中相關的T、

5、B淋巴細胞效應機制的重要信息。 本研究對MSCs在GVHD的治療前景進行了一些探索性研究。我們設計體外和體內(nèi)實驗兩個部分觀察MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用。通過觀察MSCs對由異基因樹突狀細胞及植物血凝素誘導的CD2<'+>T淋巴細胞增殖作用的影響，以及MSCs與T淋巴細胞共培養(yǎng)后，T細胞亞群比例的變化，了解MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用及其可能的機制。進一步建立父代一子代半相合小鼠骨髓移植模型，從體內(nèi)的角度研究小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞對半相合骨

6、髓移植后aGVHD的作用，同時檢測小鼠外周血T細胞亞群比例的變化以及各個靶器官中趨化因子受體CXCR3的表達情況，從而進一步探討其免疫調(diào)節(jié)作用的可能機制，為GVHD的有效防治提供理論依據(jù)。 方法 1．從人骨髓液中分離培養(yǎng)MSCs，從人臍血中分離培養(yǎng)樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)，分別將DCs和植物血凝素(PHA)作為刺激因素，經(jīng)磁珠分選的人CD2<'+>T淋巴細胞作為反應細胞，用<'3>H-TdR標

7、記β液體閃爍計數(shù)儀檢測與MSCs共培養(yǎng)前后T淋巴細胞增殖能力的變化。 2．用流式細胞儀檢測與MSCs共培養(yǎng)10d后的CD2<'+>T細胞內(nèi)各亞群Thl、Th2、Tcl、Tc2比例的變化。 3．以親代C57BL/6(H-2b♂)d,鼠為供鼠，Balb/cxC57BL/6 FI(CB6F1)為受鼠，將來源于供鼠的1×10<'6>個脾細胞、l×l0<'5>個骨髓細胞經(jīng)鼠尾靜脈輸注入7.5 Gy<'60>Coγ射線全身照射后的

8、受鼠體內(nèi)，進行半相合骨髓移植，建立aGVHD模型。同時，MSCs干預組中同時再輸入體外培養(yǎng)的C57BL/6(H-2b♂)小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞2x×lO<'5>個。 4．流式細胞術檢測供鼠(H2<'b>)及受鼠(H2b<,b×d>)陽性細胞的比例，分析移植后6周內(nèi)嵌合率的變化，鑒定骨髓移植是否成功。通過生存期、臨床表現(xiàn)、組織病理學分析移植后各組小鼠aGVHD發(fā)生的情況。 5．在移植后6周內(nèi)，運用流式細胞儀觀察小鼠外周血T

9、細胞亞群的變化，免疫組織化學觀察小鼠肝、脾、小腸、皮膚等器官中炎性細胞表面趨化因子受體CXCR3的變化。 結(jié)果 1．hMSCs能明顯抑制由DCs誘導的T淋巴細胞增殖(P=0.004)，同時MSCs可抑制由PHA引起的T細胞增殖，但不具有顯著性差異(P=0.26)，MSCs培養(yǎng)上清液單獨并不具備抑制T細胞增殖的作用。 2．與hMSCs共培養(yǎng)后的CD2<'+>T淋巴細胞中，Th2及Tc2亞群比例較共培養(yǎng)前明顯增加(P

10、<0.05)。 3．照射組、BM組及BM聯(lián)合MSCs輸注組小鼠的20周生存率分別為7.1％、45.5％、50％；組織病理學評分及GVHD臨床積分均顯示BM聯(lián)合MSCs輸注組小鼠的GVHD發(fā)生的程度較BM組明顯減輕(P<0.01)。 4．移植后6周內(nèi)，各組小鼠體內(nèi)T細胞亞群比例均有變化，其中Th2及Tc2亞群比例于MSCs組小鼠較BM組有所增加，成組t檢驗示P<0.05；MSCs組小鼠肝臟、脾臟等組織內(nèi)CXCR3的表達較B

11、M組有所下調(diào)。 結(jié)論 1．MSCs對由樹突狀細胞和PHA誘導的淋巴細胞增殖反應均具有抑制作用，并且這種作用可能與細胞間相互作用及誘導T細胞亞群向Ⅱ型T細胞極化有關。 2．輸注父代MSCs并不能明顯改善半相合骨髓移植小鼠生存率，但可減輕由aGVHD造成的靶器官損傷。 3．半相合骨髓移植后，輸注父代MSCs可增加小鼠外周血Ⅱ型T細胞亞群的比例，同時下調(diào)靶器官內(nèi)CXCR3+細胞數(shù)目。提示小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞輸注