2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、研究背景和目的:糖尿病(DM)大血管并發(fā)癥(如冠狀動(dòng)脈疾病、周圍血管疾病、中風(fēng))是2型糖尿?。═2DM)患者的主要死亡原因,超過(guò)D M相關(guān)死亡的50%。D M大血管并發(fā)癥的特點(diǎn)是加速的動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。DM和非DM個(gè)體動(dòng)脈粥樣硬化在病理解剖上是相似的,但 DM病變發(fā)生更早,波及范圍更廣泛。越來(lái)越多的證據(jù)表明,血管內(nèi)皮功能障礙和細(xì)胞凋亡是DM患者動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展中最早和最關(guān)鍵的始動(dòng)因素。D M患者血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)暴露于

2、高血糖和高脂環(huán)境從而發(fā)生凋亡并從內(nèi)膜脫落,觸發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生,導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展和大血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。雖然ECs凋亡和動(dòng)脈粥樣硬化之間的因果關(guān)系已形成共識(shí),但其潛在機(jī)制仍不完全清楚。因此,闡明內(nèi)皮細(xì)胞凋亡信號(hào)通路,有助于我們尋找減少D M患者ECs凋亡和動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的新的治療靶點(diǎn)。
  E1A激活基因阻遏子(CREG)是一種小分子糖蛋白,主要表達(dá)于分化成熟的組織細(xì)胞,在未分化的組織細(xì)胞低表達(dá)甚至不表達(dá)。有研究報(bào)

3、道,在分化成熟型血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)中CREG大量表達(dá),通過(guò)抑制VSMCs增殖、遷移并誘導(dǎo)其分化來(lái)維持VSMCs的穩(wěn)態(tài),提示CREG是一個(gè)誘導(dǎo)細(xì)胞分化的內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)控因子。本實(shí)驗(yàn)室前期一系列研究結(jié)果提示:CREG在正常血管ECs中存在高表達(dá),小鼠主動(dòng)脈和人冠狀動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化斑塊部位ECs中CREG的表達(dá)顯著減少;通過(guò)皮下埋泵方式給予高脂喂養(yǎng)的載脂蛋白E基因敲除小鼠外源性的CREG蛋白,則可明顯減輕動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),

4、CREG可能通過(guò)下述機(jī)制保護(hù)血管ECs:①通過(guò)不同的信號(hào)通路促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的增殖和遷移;②在豬冠狀動(dòng)脈損傷模型中,給予CREG蛋白涂層支架可促進(jìn)冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮修復(fù);③通過(guò)抑制NF-kappaB的激活和抑制腫瘤壞死因子a(等細(xì)胞因子刺激引起的ECs超滲透性炎癥反應(yīng);④通過(guò)VEGF/PI3K/Akt通路抑制凋亡誘導(dǎo)劑引起的ECs凋亡等。綜上所述,CREG 是對(duì)抗ECs凋亡、保護(hù)血管ECs完整性的重要調(diào)控因子。除

5、了對(duì)ECs的保護(hù)作用,CREG基因還具有抑制VSMC和骨髓干細(xì)胞凋亡的作用。然而,CREG在D M患者ECs凋亡中的作用尚不清楚,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期研究,我們擬探討動(dòng)脈粥樣硬化病理因素高糖高脂刺激下CREG基因表達(dá)與ECs凋亡變化以及引起CREG表達(dá)變化的上游調(diào)控機(jī)制。
  研究方法:
  1.經(jīng)沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),入選 DM合并下肢動(dòng)脈硬化需進(jìn)行截肢手術(shù)的病人(DM組)及因交通事故等外傷需截肢的非DM非動(dòng)脈粥樣

6、硬化患者(對(duì)照組)。分離截肢部位動(dòng)脈,通過(guò) HE染色、免疫熒光染色及原位末端標(biāo)記法(TUNEL)觀察 DM組及對(duì)照組血管E C s凋亡及人CREG(hCREG)基因表達(dá)情況,并通過(guò)Western b lo t檢測(cè)兩組血管中hCREG表達(dá)及調(diào)亡執(zhí)行分子Cleaved caspase-3的表達(dá)情況。原代培養(yǎng)HUVECs,給予不同濃度(5.5mM、11.1mM、25m M和33.3mM) D-葡萄糖(D-GLU)及不同濃度(0.2mM、0.3

7、mM、0.4mM)棕櫚酸(PA)處理24h,模擬T2 D M細(xì)胞模型,應(yīng)用Annexin V-F IT C/P I和 T U N E L染色檢測(cè)細(xì)胞調(diào)亡情況, Western b l o t及實(shí)時(shí)焚光定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè) hCREG基因及 Cleaved caspase-3表達(dá),并明確誘導(dǎo) HUVECs凋亡的最佳高糖高脂濃度。構(gòu)建低表達(dá)和過(guò)表達(dá)hCREG基因的HUVECs,篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞并建立細(xì)胞系,分別給予高糖高脂刺激2

8、4h,通過(guò)Annexin V-FITC/PI, TUNEL染色及Western b lo t檢測(cè)細(xì)胞調(diào)亡及hCREG、Cleaved caspase-3表達(dá)情況,進(jìn)一步證實(shí)高糖高脂環(huán)境下HUVECs中hCREG基因表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。
  2.通過(guò)生物信息學(xué)(N C B I的GenBank)初步預(yù)測(cè)hCREG啟動(dòng)子區(qū)位置,構(gòu)建包含 hCREG基因啟動(dòng)子區(qū)不同截短片段的雙熒光素酶報(bào)告基因及增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)報(bào)告基因,通過(guò)

9、檢測(cè)焚光素酶活性及觀察綠色熒光強(qiáng)度確定h C R E G基因核心啟動(dòng)子區(qū)位置。再結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(TF)基因芯片篩查、生物信息學(xué)預(yù)測(cè)(Promo在線預(yù)測(cè)軟件)、染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)等實(shí)驗(yàn),確定hCREG核心啟動(dòng)子區(qū)可能結(jié)合的TF。
  3.缺失突變TF可能與hCREG基因結(jié)合的位點(diǎn),構(gòu)建含缺失突變位點(diǎn)的雙熒光素酶報(bào)告基因,與未突變的報(bào)告基因相比活性有明顯差異的位點(diǎn)即為對(duì)hCREG起關(guān)鍵調(diào)控作用的TF結(jié)合位點(diǎn)。提取D M患者動(dòng)脈

10、粥樣硬化血管與正常對(duì)照血管RNA及蛋白,通過(guò)定量PCR和 Western b lo t檢測(cè)該T F的表達(dá),明確與hCREG表達(dá)的相關(guān)性。構(gòu)建過(guò)表達(dá)該T F的 pcDNA3.1(+)載體,通過(guò) Annexin V-FITC/PI、T U N E L染色及Western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)該TF對(duì)高糖高脂誘導(dǎo)的HUVECs中hCREG表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響。明確該T F對(duì)高糖高脂環(huán)境下hCREG基因表達(dá)的調(diào)控作用。
  研允結(jié)果:

11、>  1. D M患者血管ECs和高糖高脂刺激下的HUVECs中hCREG基因表達(dá)減少,ECs凋亡增加。
  H E染色可見(jiàn),D M血管內(nèi)膜明顯增厚,斑塊突入管腔;免疫熒光染色顯示, D M組血管內(nèi)皮中hCREG基因表達(dá)較對(duì)照組血管明顯減少,TUNEL染色顯示D M組血管比對(duì)照組血管ECs凋亡明顯增多。Western blot檢測(cè)可見(jiàn)D M血管hCREG表達(dá)明顯減少而Cleaved caspase-3的表達(dá)明顯增多,提示h C R

12、 E G可能參與了 D M患者血管ECs凋亡的過(guò)程。
  首先確定25m M的D-G LU為最佳高糖刺激濃度,可使HUVECs凋亡顯著增多但細(xì)胞死亡無(wú)明顯增多。Annexin V-F IT C/P I和 T U N E L染色檢測(cè)顯示高糖(25mM D-G L U)加不同濃度高脂(0.2、0.3、0.4mM P A)刺激24 h后隨P A濃度增高,HUVECs凋亡呈劑量依賴性增加。Western blot及定量PCR結(jié)果顯示hCR

13、EG基因表達(dá)隨高脂濃度增高呈劑量依賴性減少,而 Cleaved caspase-3明顯增多,即調(diào)亡增加。此部分實(shí)驗(yàn)顯示高糖高脂刺激可引起HUVECs中hCREG基因表達(dá)減少,細(xì)胞凋亡增加。
  為進(jìn)一步明確hCREG基因在高糖高脂誘導(dǎo)的HUVECs凋亡中的作用,構(gòu)建了低表達(dá)和過(guò)表達(dá)hCREG基因的HUVECs,篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并建立細(xì)胞系,分別給予高糖高脂刺激24h,通過(guò)Western blot、定量PCR、Annexin V-

14、FITC/PI和 TUNEL染色檢測(cè),結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)hCREG可以明顯減輕高糖高脂誘導(dǎo)的HUVECs凋亡,而低表達(dá)hCREG可加重HUVECs凋亡。提示hCREG是高糖高脂條件下血管ECs凋亡增加的直接原因。
  以上組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)均表明,高糖高脂環(huán)境下通過(guò)下調(diào)hCREG基因表達(dá)可以引起HUVECs凋亡增加。調(diào)控基因表達(dá)最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,其中順式作用元件(主要指啟動(dòng)子)與反式作用因子(如 TF)是兩個(gè)基本的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

15、元件。目前 hCREG基因核心啟動(dòng)子區(qū)定位和調(diào)控其表達(dá)的T F尚不清楚。
  2. hCREG基因核心啟動(dòng)子區(qū)的確立和關(guān)鍵T F的篩選
  通過(guò)生物學(xué)(N C B I的GenBank)預(yù)測(cè)hCREG啟動(dòng)子區(qū)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(定義為+1)上游約2000bp范圍內(nèi),構(gòu)建包含hCREG基因啟動(dòng)子區(qū)不同截短片段的雙熒光素酶報(bào)告基因 pGL4.12-hCREG-2003(-1925/+78)、pGL4.12-hCREG-945 C-8

16、67/+78)、pGL4.12-hCREG-586(-508/+78)、 pGL4.12-hCREG-478(-400/+78)和pGL4.12-hCREG-358(-280/+78),將這些質(zhì)粒分別與參照質(zhì)粒pGL4.73共轉(zhuǎn)染于人胚胎腎上皮293T和 HUVECs48h,按照雙熒光素報(bào)告基因系統(tǒng)操作說(shuō)明書(shū),檢測(cè)熒火蟲(chóng)焚光素酶(Firefly luciferase,F(xiàn)luc)與海腎素焚光素酶活性(Renila luciferase,R

17、luc)。首次確定了 h C R E G基因高水平轉(zhuǎn)錄的最小核心啟動(dòng)子區(qū)域位于hCREG-568(-508/+78)片段;而 hCREG-586(-508/+78)和 hCREG-358(-280/+78)之間熒光素酶活性出現(xiàn)較大落差,提示-508/-281片段在hCREG基因表達(dá)中起關(guān)鍵調(diào)控作用。另外分別構(gòu)建pEGFP1綠色熒光報(bào)告基因pEGFP1-hCREG-2003、pEGFP1-hCREG-945、pEGFP1-hCREG-58

18、6^pEGFP1-hCREG-478和 pEGFP1-hCREG-358系列報(bào)告基因載體,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后直接在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光轉(zhuǎn)染效率和強(qiáng)度,得到相似結(jié)果?;谝陨辖Y(jié)果,合成hCREG基因-508/+78的D N A片段,通過(guò)T F基因芯片篩查、生物信息學(xué)預(yù)測(cè)(P ro m o在線預(yù)測(cè)軟件)、C h IP實(shí)驗(yàn)等確定了核心啟動(dòng)子區(qū)域hCREG-586(-508/-281)最有可能結(jié)合的TF有 GATA1和ETS1。
  

19、3.過(guò)表達(dá)GATA1可以通過(guò)上調(diào)hCREG表達(dá)而減少高糖高脂誘導(dǎo)的HUVECs凋亡。
  通過(guò)缺失突變方法確定了對(duì)hCREG起關(guān)鍵調(diào)控作用的TF為GATA1,其與hCREG的結(jié)合位點(diǎn)位于-297/-292。將此位點(diǎn)缺失突變后,hCREG基因轉(zhuǎn)錄活性降低約83.3%。而 GATA1(-467/-462)及 ETS1(-312/-306)缺失突變前后hCREG基因轉(zhuǎn)錄活性無(wú)明顯變化。提取DM患者動(dòng)脈粥樣硬化血管與對(duì)照血管,通過(guò)定量P

20、C R和 Western b lo t檢測(cè)發(fā)現(xiàn)D M患者血管中GATA1明顯減少,與hCREG基因表達(dá)成正相關(guān)。
  為了更進(jìn)一步驗(yàn)證GATA1對(duì) hCREG的調(diào)控作用,構(gòu)建了 pcDNA3.1(+)過(guò)表達(dá)G A T A1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的H U V E C s細(xì)胞模型,給予高糖高脂刺激24h,Annexin V-FITC/PI和 TUNEL染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)GATA1后高糖高脂誘導(dǎo)的HUVECs凋亡減少47%和21%,均有顯著差異。定

21、量PCR和 Western b lo t檢測(cè)結(jié)果則表明,過(guò)表達(dá)GATA1后 hCREG表達(dá)上調(diào)2?4倍。
  本部分的研究結(jié)果提示GATA1是上調(diào)hCREG表達(dá)的關(guān)鍵上游調(diào)控分子,GATA1過(guò)表達(dá)可以通過(guò)上調(diào)hCREG表達(dá),對(duì)抗高糖高脂誘導(dǎo)的血管ECs凋亡。
  結(jié)論:綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn):①T2DM患者動(dòng)脈粥樣硬化血管比非D M患者血管內(nèi)皮細(xì)胞中hCREG基因表達(dá)減少而細(xì)胞凋亡明顯增多;②高糖(25 mM D-GLU)加不

22、同濃度高脂(0.2、0.3、0.4mM P A)刺激24 h后,隨高脂濃度增高H U V E C s凋亡呈劑量依賴性增多,hCREG基因表達(dá)呈劑量依賴性減少。③過(guò)表達(dá)hCREG基因可以使高糖高脂誘導(dǎo)的HUVECs凋亡減少,而低表達(dá)hCREG基因可以使高糖高脂誘導(dǎo)的HUVECs凋亡進(jìn)一步增加;④研究表明,hCREG基因關(guān)鍵啟動(dòng)子區(qū)位于-508/+78,GATA1可能與該區(qū)內(nèi)-297/-292位點(diǎn)結(jié)合,將此位點(diǎn)缺失突變后,C R E G基因

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