葉酸對同型半胱氨酸誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷保護作用機制的研究.pdf

1、目的：
　　多種血管疾病的初期均會出現(xiàn)血管內皮細胞損傷的病理生理改變，血管內皮細胞損傷是動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）發(fā)生的重要環(huán)節(jié)之一，因此保護血管內皮細胞對于防治AS相關疾病有著重要的意義。流行病學研究和基礎研究均表明在AS的發(fā)生早期常伴有高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteine， HHcy）。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）會引起血管內皮細胞的損傷，進而促進AS的發(fā)生。葉酸

2、作為輔酶參與Hcy代謝。本研究觀察葉酸（folic acid， FA）對Hcy引起的人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells， HUVEC）損傷的保護作用，探討其中機制，為AS防治提供科學依據(jù)。
　　方法：
　　本實驗采用不同濃度葉酸（0-1000 nmol/L）作用于HUVEC48 h（前24h同時進行1000μmol/L Hcy孵育及空白對照）。分別采用MTT法檢測不

3、同濃度葉酸作用下 HUVEC細胞活性，計算細胞生長抑制率；丙二醛（ methane dicarboxylic aldehyde，MDA）測定試劑盒檢測細胞中MDA含量；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測定試劑盒檢測細胞培養(yǎng)液中LDH活性；化學發(fā)光微粒子免疫法檢測細胞中葉酸水平；高效液相色譜法（high performance liquid chromatography， HPLC）檢測細胞內 Hcy、S-

4、腺苷同型半胱氨酸（s-adenosylhomocysteine，SAH）和S-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine，SAM)水平；RT-PCR檢測血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）的mRNA表達水平；免疫印跡（Western Blot）檢測VEG

5、F、MCP-1的蛋白表達水平；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）測定試劑盒檢測細胞的總抗氧化能力；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒測定細胞 SOD活性；還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒檢測細胞中GSH含量；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測試劑盒檢測細胞GSH-Px活性；流

6、式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測細胞凋亡率；RT-PCR檢測抑制凋亡基因Bcl2的mRNA水平和促凋亡基因TP53、Caspase-3、Caspase-4、Caspase-6、Caspase-8和Caspase-9的mRNA水平；Caspase-3/7檢測試劑盒檢測細胞中Caspase-3/7活性。
　　結果：
　　與正常對照組（葉酸濃度為20 nmol/L）相比，Hcy干預降低了細胞活性，升高了細胞生長

7、抑制率。對照組細胞排列整齊緊密，Hcy干預后細胞排列疏松。葉酸干預使細胞形態(tài)明顯改善，細胞數(shù)目顯著增多，且葉酸高劑量組作用最明顯。葉酸作用于Hcy孵育的細胞后，增強了細胞活性，降低了細胞生長抑制率。葉酸干預降低了細胞氧化損傷程度，與 Hcy+FA-N組相比，Hcy+FA-H組細胞MDA含量減少、LDH活性降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。葉酸增強了細胞的抗氧化能力，與Hcy+FA-N組相比，Hcy+FA-H組細胞總抗氧化能力（

8、T-AOC）、SOD活性、細胞內GSH含量和GSH-Px活性均升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。葉酸降低了細胞中Hcy、SAH濃度，升高了SAM濃度。葉酸可提高VEGF的mRNA和蛋白的表達水平，降低MCP-1的mRNA和蛋白的表達水平。葉酸上調了抑制凋亡基因Bcl2的mRNA表達水平，下調了促凋亡基因TP53、Caspase-3、Caspase-4和Caspase-8的mRNA表達水平，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。促凋亡

9、基因Caspase-6和Caspase-9的mRNA水平在各組之間無差異（P＞0.05）。葉酸降低了細胞的Caspase-3/7活性。
　　結論：
　　葉酸可改善由 Hcy引起的細胞損傷，提高細胞活性，降低生長抑制率，改善內皮功能，增強細胞的抗氧化能力，降低細胞凋亡率，葉酸對 Hcy引起的內皮細胞損傷具有一定的保護作用。其可能的機制為葉酸通過調節(jié)與AS進展相關的VEGF和MCP-1的基因和蛋白的表達水平改善內皮功能；葉酸通過