脂多糖體外誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、內(nèi)毒素(endotoxin)為革蘭氏陰性菌(Gram’s negative，G)細(xì)胞壁的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)組分，是引起膿毒血癥(sepsis)和感染性休克(septic shock)的關(guān)鍵因素。內(nèi)毒素激活多種細(xì)胞因子，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，最終導(dǎo)致多器官功能衰竭(multiple organ failure,MOF)。目前，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為膿毒血癥并發(fā)多器官功能衰竭可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、

2、宿主過(guò)度反應(yīng)性及免疫網(wǎng)絡(luò)失控等因素有關(guān)，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡在膿毒血癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，但是確切的機(jī)理尚不清楚。 研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋整個(gè)循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)表面，不僅起屏障作用，還有調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝產(chǎn)物、調(diào)節(jié)血管舒張、止血和趨化白細(xì)胞的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和生存的協(xié)調(diào)狀態(tài)，是保證正常血管功能和結(jié)構(gòu)的重要基礎(chǔ)，是維持血管穩(wěn)態(tài)的決定性因素。血管內(nèi)皮細(xì)胞是一種代謝活躍的細(xì)胞，體內(nèi)外多種刺激因子均可作用于內(nèi)皮細(xì)胞，從而誘發(fā)凋亡

3、。血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，會(huì)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的再生，導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)的破壞，還會(huì)影響血管內(nèi)皮依賴性舒張功能，甚至還可影響到血管周?chē)慕M織細(xì)胞，因此深入了解血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡發(fā)生發(fā)展的規(guī)律，對(duì)尋找保護(hù)內(nèi)皮的措施有重要意義。 在感染性休克、多器官功能障礙綜合征時(shí)，如何及時(shí)保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，維持內(nèi)皮細(xì)胞功能正常，將對(duì)保護(hù)心臟、肺、腦、肝臟等重要臟器功能有積極的作用。因此，本課題設(shè)計(jì)對(duì)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞施以不同濃度脂多糖處理后，檢測(cè)在

4、各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞凋亡率，分析不同濃度脂多糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的差異，為深入研究膿毒血癥的發(fā)病機(jī)理和抗細(xì)胞凋亡治療提供理論基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)材料與方法： 一、實(shí)驗(yàn)材料 1、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304細(xì)胞株 2、主要試劑及藥品 DMEM/F-12培養(yǎng)基、脂多糖、0.25％胰蛋白酶、10％胎牛血清、AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、四甲基偶氮唑鹽、二甲基亞砜。 3、主

5、要儀器 超凈工作臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫離心機(jī)、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板、超低溫冰箱、倒置相差顯微鏡、全自動(dòng)酶標(biāo)儀、微孔濾器、流式細(xì)胞儀。 二、實(shí)驗(yàn)方法： 1、細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)72小時(shí)，加入2/ml0.25％胰蛋白酶消化，2～3分鐘后吸出消化液棄掉，再加入含10％胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻細(xì)胞，按1：2傳代于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。于37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天換液一次，

6、3～4天傳代一次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至一定數(shù)量后，取培養(yǎng)24h的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 2、實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將細(xì)胞分為4組：空白對(duì)照組、1組(脂多糖濃度為6.25ug/ml)、2組(脂多糖濃度12.5ug/ml)、3組(脂多糖濃度25ug/ml)及4組(脂多糖濃度50ug/ml)。每組3個(gè)標(biāo)本，分別于4h、12h、24h及48h收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 3、Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)

7、胞凋亡 按照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在流式細(xì)胞儀上每個(gè)標(biāo)本計(jì)數(shù)1×104個(gè)細(xì)胞。 4、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，運(yùn)用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用多個(gè)樣本均數(shù)兩兩比較的SNK法，P<0.05有顯著性差異。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 一、脂多糖對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響在倒置相差顯微鏡下觀察正常對(duì)照組培養(yǎng)24h的

8、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，大部分細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈梭性或不規(guī)則三角形，核清晰，有些細(xì)胞魚(yú)貫狀相連；而脂多糖處理組細(xì)胞形態(tài)有明顯受損的改變，胞體變圓、邊緣不清、受損細(xì)胞發(fā)生皺縮，近似細(xì)胞凋亡表現(xiàn)。 二、MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞被脂多糖干預(yù)后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，脂多糖的濃度與細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率成正比，從脂多糖濃度為3.125 ug/ml時(shí)的20.16％，到脂多糖濃度200 ug/ml時(shí)的91.68％。其中，細(xì)胞生長(zhǎng)抑

9、制率變化明顯、并且吸光度值有顯著差異的脂多糖濃度為6.25 ug/ml～50 ug/ml(P<0.05)，因此接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)選擇6.25ug/ml、12.5ug/ml、25 ug/ml及50 ug/ml脂多糖濃度分組。 三、流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 不同濃度脂多糖組在4h、12h、24h及48h的細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較都有顯著差異(P<0.05)，即脂多糖能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；而各脂多糖濃度組之

10、間比較，除在4h時(shí)無(wú)顯著差異(P>0.05)外，在12h、24h及48h都有顯著差異，即在12h、24h及48h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)脂多糖濃度增大，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率隨之增加； 同一濃度脂多糖組在4h、12h及24h時(shí)的細(xì)胞凋亡率有顯著差異(P<0.05)，但是與48h比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即在4h～24h之間，一定濃度的脂多糖作用于內(nèi)皮細(xì)胞，隨時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率增加。 結(jié)論： 1、脂多糖能夠在體外抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)。