Melatonin抑制缺氧誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞遷移的機制研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　第一部分：Melatonin抑制缺氧狀態(tài)下人臍靜脈內(nèi)皮細胞的遷移及HIF-1α的表達
　　目的：探討Melatonin對缺氧狀態(tài)下HUVECs遷移及HIF-1α表達的影響。
　　方法：1、HUVECs分別予常氧狀態(tài)、缺氧、缺氧加melatonin處理，以細胞劃痕實驗及實驗檢測HUVECs遷移率。2、HUVECs在缺氧和常氧條件下培養(yǎng)，以免疫印跡法檢測HIF-1α的表達；經(jīng)melatonin干預(yù)后

2、，HUVECs暴露于缺氧狀態(tài)后以免疫印跡法檢測HIF-1α的表達；3、HUVECs轉(zhuǎn)染HIF-1αsiRNA后在缺氧狀態(tài)下培養(yǎng)，以細胞劃痕實驗檢測HUVECs遷移率。
　　結(jié)果：1，缺氧狀態(tài)下HUVECs的遷移較常氧狀態(tài)增加，melatonin作用后可使HUVECs遷移下降，melatonin的作用與劑量成正比。2，缺氧后HIF-1α表達增加，HIF-1α被siRNA干擾后HUVECs遷移受到抑制。Melatonin通過抑制缺氧后

3、HIF-1α的表達而使HUVECs遷移受到抑制。
　　結(jié)論：Melatonin可抑制缺氧誘導(dǎo)的HUVECs遷移，其作用呈劑量依賴性；melatonin抑制缺氧后HIF-1α的表達進而抑制HUVECs遷移。
　　第二部分：Rac1參與Melatonin抑制缺氧誘導(dǎo)HUVECs遷移的機制研究
　　目的：探討Rac1參與Melatonin抑制缺氧誘導(dǎo)HUVECs遷移的機制。
　　方法：1，HUVECs在缺氧及常氧狀態(tài)培

4、養(yǎng)后以GST-pulldown實驗檢測Rac1活性；2，HUVECs轉(zhuǎn)染Rac1-V12 或空載體質(zhì)粒（對照組）后予以melatonin干預(yù)，以GST-pulldown實驗檢測Rac1活性，以免疫印跡法檢測HIF-1α的表達,以細胞劃痕實驗檢測HUVECs遷移率。3，HUVECs轉(zhuǎn)染Rac1-T17N或空載體質(zhì)粒（對照組），以細胞劃痕實驗檢測缺氧狀態(tài)下HUVECs遷移情況。4，以細胞免疫熒光染色檢測缺氧狀態(tài)下Rac1的定位。5，以免疫印

5、跡法檢測細胞溶菌產(chǎn)物ERK磷酸化程度；HUVECs經(jīng)ERK抑制劑U0126干預(yù)后以細胞劃痕實驗檢測HUVECs遷移率。
　　結(jié)果：1，Melatonin抑制缺氧狀態(tài)下HUVECs中HIF-1α的表達，該過程需要Rac1參與。2，Melatonin對缺氧誘導(dǎo)的HUVECs細胞遷移的抑制作用與其阻斷Rac1活化有關(guān)。3，缺氧可促進Rac1從細胞漿中（可溶部分）轉(zhuǎn)移到細胞骨架（不溶部分），而且這種現(xiàn)象可被melatonin逆轉(zhuǎn)。4，ER