谷氨酰胺對內(nèi)毒素血癥幼年大鼠小腸上皮ERK及p38活性影響.pdf

1、目的:
　　 觀察谷氨酰胺(Gln)在內(nèi)毒素血癥時對幼年大鼠小腸上皮信號轉(zhuǎn)導通路ERK、p38活性的影響,探討谷氨酰胺對內(nèi)毒素血癥幼年大鼠小腸上皮的保護機制。
　　 方法:
　　 選清潔級18日齡Wistar大鼠96只(由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供),雌雄不拘,體質(zhì)量(27.0±4.0)g。隨機分成對照組(腹腔注射生理鹽水1mL/kg);LPS組(腹腔注射內(nèi)毒素5mg/kg,配比濃度為5g/L,用生理鹽水溶解)

2、,;Gln組(谷氨酰胺組腹腔注射內(nèi)毒素同時腹腔注射N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺2g/kg,濃度20%,含L-谷氨酰胺13.46%),每組2、6、24、72h各時點8只。各組于上述指定時間點以脊椎脫臼法處死,取全部回腸,用冰鹽水灌洗清除小腸內(nèi)容物,分別置于4%多聚甲醛固定12～16h留取組織標本,進行常規(guī)HE染色,光學顯微鏡觀察組織大體改變,免疫組化染色;取回腸組織切塊(1mm*1mm*1mm)投入2.5%戊二醛固定液固定,梯度酒精

3、脫水,Epon包埋后制成超薄切片,在透射電鏡下觀察小腸粘膜超微結(jié)構(gòu);迅速取回腸組織于EP管液氮中速凍后移至-80℃冰箱中保存用做Real-timePCR進行實時定量分析。
　　 免疫組化染色及結(jié)果判定方法:采用免疫組化二步法檢測對照組、內(nèi)毒素組、谷氨酰胺組中ERK和P38蛋白的表達。ERK鼠單克隆抗體、p38兔多克隆抗體均購自北京中杉金橋生物有限公司,工作濃度為1:50,免疫組化及DAB顯色試劑盒購自北京中杉生物有限公司。用PB

4、S代替一抗做陰性對照。結(jié)果判定:ERK和p38蛋白在細胞漿或細胞核中呈現(xiàn)清晰棕黃色特異性免疫反應顆粒為陽性細胞。取組化染色片(陽性者表現(xiàn)為胞質(zhì)或胞核棕黃色顆粒),在每張切片上隨機選取5個視野照相,采用日本產(chǎn)OLYMPUS攝像系統(tǒng)和MetaMorph/BX41型圖像數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)測定積分吸光度值,進行數(shù)據(jù)分析。
　　 Real-timePCR與結(jié)果判定:按TRIZOI法抽提總RNA(按試劑說明書提取總RNA);并經(jīng)紫外分光光度計測定

5、,計算提取RNA濃度和純度;并對總RNA完整性進行鑒定;反轉(zhuǎn)錄擴增cDNA:進行PCR擴增(取cDNA3U1(1ug),10*Buffer2uL,Mgc124U1,10mmol/LdNTPs2uL,引物100ng,TagDNA多聚酶1uL,總體系20uL。循環(huán)條件:Stage1:預變性95℃30秒20℃/秒;Stage2:PCR反應95℃5秒20℃/秒,60℃20秒20℃/秒;Stage3:溶解曲線分析95℃0秒20℃/秒,65℃15秒

6、20℃/秒,95℃0秒0.1℃/秒,共41個循環(huán)。結(jié)果判定:確認Real-timePCR反應的擴增曲線及溶解曲線,判斷擴增效率及特異性,調(diào)節(jié)基線至適宜處(指數(shù)擴增的起始處),各擴增曲線與基線的交叉點對應的即為CT值:采用deltadeltaCT相對定量法進行分析。
　　 結(jié)果:
　　 注藥后表現(xiàn):內(nèi)毒素組幼年大鼠注藥后出現(xiàn)腹瀉、呼吸加快、口唇、四肢及尾巴青紫,四肢末梢涼,腹脹加重,對外界聲音刺激反應能力明顯下降或不出現(xiàn)反

7、應等臨床表現(xiàn)均較谷氨酰胺組出現(xiàn)早并且重。內(nèi)毒素組總體亡率約為15%,谷氨酰胺組總死亡率為10%左右。對照組未見明顯異常,3d內(nèi)體質(zhì)量增長良好。病理改變及電鏡觀察:HE染色后光鏡下對照組小腸黏膜結(jié)構(gòu)正常,LPS組和谷氨酰胺組各時點小腸粘膜有不同程度的充血、水腫及炎癥改變,Gln組各時點與LPS組比較均減輕:電鏡下觀察對照組小腸上皮超微結(jié)構(gòu)正常,LPS組可出現(xiàn)染色質(zhì)邊集、濃縮、核碎裂甚至出現(xiàn)凋亡小體,Gln組各時點與LPS組比較小腸上皮炎癥

8、反應表現(xiàn)均有所減輕。免疫組化:LPS組和Gln組各時點小腸上皮細胞可見沉積于胞質(zhì)或胞核棕黃色ERK-2及P38顆粒明顯高于對照組。LPS組ERK及p38表達較Gln組相同時點增強,以6h差異最顯著,有統(tǒng)計學意義(P≤0.05)。Real-timePCR:LPS組及Gln組ERK及p38的rnRNA表達均較對照組增高,LPS組較Gln組ERK和p38表達增高,差異有統(tǒng)計學意義(P≤0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 ERK及