2BFI對EAE小鼠淋巴細(xì)胞亞群的免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的:雖然本實驗室已經(jīng)證實咪唑啉-2受體(I2R)特異性配體2BFI對小鼠多發(fā)性硬化模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmuneencephalomyelitis，EAE)的發(fā)生有保護(hù)作用，但是機(jī)制未明。本研究主要觀察2BFI整體實驗干預(yù)下對EAE小鼠中樞和外周的淋巴細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子的變化，從而探討2BFI對EAE干預(yù)作用的細(xì)胞免疫學(xué)機(jī)制。
　　方法與內(nèi)容: SPF級C57BL/6小鼠:雌性，

2、6-8周齡，體重14～16g。用MOG35-55免疫C57BL/6小鼠制作EAE模型，將小鼠隨機(jī)分為3組:CFA對照組(CFA-controlgroup)，EAE模型對照(EAE-control group)組，2BFI藥物干預(yù)組(EAE-2BFI20 mg·kg-1group)。EAE對照組2BFI干預(yù)組小鼠用MOG35-55混合CFA制成抗原乳劑皮內(nèi)注射，CFA對照組以生理鹽水代替抗原肽制備抗原乳劑皮內(nèi)注射，0、48小時腹腔注射PT

3、造模。2BFI干預(yù)組于免疫當(dāng)天開始腹腔注射給藥，每天兩次，連續(xù)14天。CFA對照組和EAE對照組組腹腔注射生理鹽水(NS)代替。自免疫當(dāng)日定為第0天，每日兩次觀察并記錄動物行為學(xué)及體重的變化。采用量化評分法，比較不同組別的EAE發(fā)病率、潛伏期、癥狀評分。CFA對照組于20天處死，其他各組動物于發(fā)病高峰期處死。取神經(jīng)組織（腰髓）用多聚甲醛固定，行HE染色觀察評價組織炎癥病理變化;用流式細(xì)胞檢測術(shù)(FCM)分析中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)及脾臟C

4、D4+T、CD8+T、CD4+TCD25+Treg、B cell及CD39的變化。用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-pcr)法測定小鼠大腦干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白介素-10(interleukin-10，IL-10)和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ，TGF-β) mRNA的表達(dá)

5、。
　　結(jié)果:
　　1、發(fā)病率和行為學(xué)變化:EAE對照組小鼠最早發(fā)病于免疫后第13天(13dpi)。各組動物EAE誘發(fā)率分別為CFA(0/8)，EAE(8/8)，EAE-2BFI(3/8)，提示2BFI干預(yù)后EAE誘發(fā)率呈下降趨勢，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05)。2BFI藥物干預(yù)組的最大臨床癥狀評分平均值(2.88±1.44)較EAE對照組(9.44±0.53)明顯降低(P＜0.01)。發(fā)病小鼠表現(xiàn)為活動減少、進(jìn)食減少、體重減

6、輕，先出現(xiàn)尾張力降低、尾巴拖地不能抬起，繼而步態(tài)異常、后肢無力、癱瘓。CFA對照組小鼠未見發(fā)病，體重呈現(xiàn)緩慢上升。
　　2、病理學(xué)改變:CFA對照組小鼠脊髓的組織病理學(xué)檢查所見H.E.染色正常。EAE對照組小鼠可見脊髓內(nèi)彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤及大量的炎性病灶，病灶處小血管管周有大量的炎性細(xì)胞浸潤，成“血管袖套樣改變”。2BFI干預(yù)組小鼠腦脊髓炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。組織損害病理（異常）發(fā)生率較EAE對照組降低（P＜0.05），炎癥病理評

7、分較EAE對照組降低（P＜0.05)。
　　3、流式細(xì)胞檢測淋巴細(xì)胞亞群變化的結(jié)果:①外周淋巴細(xì)胞亞群檢測的結(jié)果:與CFA對照組相比，EAE對照組和2BFI藥物干預(yù)組小鼠外周CD4+T、CD8+T均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而EAE對照組與2BFI干預(yù)組比較差別不大。而此兩組CD4+TCD25+Treg、B cell、CD39較CFA對照組均明顯增加（P＜0.05)，其中B cell在2BFI干預(yù)組的表達(dá)低于EAE對

8、照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)。
　　②中樞各淋巴細(xì)胞亞群變化的比較:CFA對照組小鼠中樞未檢測到淋巴細(xì)胞浸潤，2BFI藥物干預(yù)組小鼠中樞CD4+T、CD8+T、CD4+TCD25+Treg的表達(dá)較EAE對照組降低，其中CD4+T、CD4+TCD25+Treg的變化有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），B cell、CD39的表達(dá)較EAE對照組增加且均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)。
　　4、RT-PCR檢測炎癥細(xì)胞因子的變化

9、:與CFA對照組比較，EAE對照組小鼠CNS內(nèi)表達(dá)IFN-γmRNA的水平明顯增加;與EAE對照組比較，2BFI干預(yù)組小鼠CNS內(nèi)IFN-γmRNA水平均降低(P＜0.05)，而TGF-β、IL-10mRNA水平均升高（P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、本實驗中，EAE發(fā)病小鼠臨床癥狀與文獻(xiàn)報道相似，中樞病理學(xué)檢測有彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤，F(xiàn)CM檢測證實EAE致病過程中有CD4+T、CD8+T浸潤，而且B cell、CD39

10、、CD4+TCD25+Treg及相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ、TGF-β、IL-10均參與調(diào)控EAE發(fā)病，證明實驗所制作的小鼠EAE的模型是成功的，符合要求的。
　　2、2BFI干預(yù)對EAE小鼠具有明顯保護(hù)作用，主要表現(xiàn)在2BFI干預(yù)組小鼠發(fā)病率降低，臨床癥狀和病理組織學(xué)損傷程度減輕。
　　3、2BFI能抑制EAE過程中外周活化的T淋巴細(xì)胞進(jìn)入CNS，抑制致病性CD4+T、CD8+T在中樞的表達(dá)，上調(diào)與EAE恢復(fù)相關(guān)的B cell