雙歧桿菌對內(nèi)毒素損傷幼年大鼠腸道保護機制的研究.pdf

1、本研究以腹腔注射內(nèi)毒素(LPS)致幼鼠腸損傷為研究對象，應用分子生物學、組織化學及病理形態(tài)學的研究方法動態(tài)觀察幼鼠腸損傷的形態(tài)學演變過程，研究幼鼠血清和回腸組織的氧自由基損傷、炎癥介質(zhì)損傷以及腸道的非特異免疫和IGF-1的保護機制，同時探討外源性雙歧桿菌對回腸組織的保護機制，為臨床上預防胃腸功能障礙患兒發(fā)展為MODS/SIRS提供新的治療手段和理論支持。 材料和方法 一、動物模型 健康18同齡Wistar大鼠隨機

2、分為3組，對照組(C組)腹腔注射生理鹽水(1ml/kg)，模型組(E組)腹腔注射內(nèi)毒素(LPS，5mg/kg，用生理鹽水配成5mg/ml)；治療組(T組)注射LPS前1周給予雙歧桿菌混懸液(2.0x10<'9>CFU/ml)灌胃，每次0.5ml，每日2次，直至實驗結(jié)束。要補充實驗過程中死亡動物，以達到所設定的標本數(shù)(每組每個時間點8只)。 二、實驗標本采集及處理 分別于腹腔注射內(nèi)毒素或生理鹽水后2、6、12、24和72h

3、斷頭處死動物，按以下方法留取和保存血清和回腸組織。 1、斷頭取血，離心(3500 r/min)1.5min，取血清-20℃保存，用于組織化學測定。 2、冰生理鹽水沖洗腸腔內(nèi)容物后，留取距回盲部2-3cm處回腸0.5-1cm，置于0.1mol/L PBS配置的4％多聚甲醛溶液中固定，用于H-E染色后觀察組織病理學改變和免疫組織化學研究。 3、留取距回盲部3-4cm處回腸2-3cm，置于去RNA酶的Eppendorf

4、管中，放入液氮后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中，用于提取總RNA后進行RT-PCR研究。 4、余下近回盲部回腸用濾紙吸干水分后，稱重，用生理鹽水或勻漿介質(zhì)制成5％組織勻漿，離心(3000r/min)10min，留上清-20℃保存，用于組織化學測定。 三、實驗方法及檢測指標 (一)回腸形態(tài)學研究 1、大體觀察觀察 腹腔注射LPS或生理鹽水后各組動物的反應情況；各組動物于各時間點處死后，剖開腹腔，觀察腸管顏色、有

5、無水腫、出血及擴張。 2、光鏡觀察 固定后的回腸組織常規(guī)脫水，石蠟包埋，做4-5μm連續(xù)切片，常規(guī)蘇木精.伊紅(H-E)染色，光鏡下觀察腸組織形念學改變。 (二)組織化學方法檢測血清和回腸組織SOD、MDA和MPO含量。 (三)免疫組織化學方法檢測回腸組織胰島素樣生長因子(IGF-1)和細胞問黏附分子-1 (ICAM-1)蛋白質(zhì)表達。 (四) RT-PCR法檢測回腸防御素-5 (Defensin-

6、5)、IGF-1 和ICAM-1 mRNA表達。 四、統(tǒng)計學分析采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，計量資料結(jié)果以均值±標準差(X±SD)表示，組間比較采用t檢驗法，P<0.05提示差異有顯著性意義。 結(jié)果 一、各實驗組幼鼠回腸組織病理形態(tài)學改變 (一)大體改變動物實驗中可見注射LPS后幼鼠出現(xiàn)懶動、萎靡、食欲下降，1-2h出現(xiàn)腹脹、腹瀉，6-12h時上述癥狀加重，同時出現(xiàn)呼吸急促，口唇青紫，少動，體毛凌亂、少光

7、澤，嚴重者抽搐，四肢青紫，周身涼，甚至死亡。存活者24h時上述癥狀部分緩解，72h基本恢復正常；提前給予雙歧桿菌菌懸液灌胃的幼鼠癥狀較模型組輕，且恢復快。動物處死后，剖開腹腔可見對照組幼鼠腸管有光澤，顏色正常(淡黃色)；LPS組可見胃潴留明顯，腸壁及腸系膜充血，腸管擴張、水腫，腸腔滲出物增多，嚴重者見腸壁點、片狀出血，以6h組表現(xiàn)明顯；雙歧桿菌組幼鼠腸管所見較LPS組減輕。 (二)H-E染色后光鏡下變化對照組小腸絨毛完整；內(nèi)毒素

8、組腹腔注射LPS后2h無明顯異常，6h可見小腸絨毛腺體脫落、缺失，紋狀緣變薄或缺失，腸絨毛高矮不一，密度減低，固有層毛細血管充血，炎細胞浸潤，12h部分腸絨毛上皮細胞開始修復，24h修復明顯，72h基本正常；雙歧桿菌組腹腔注射LPS后2h未見明顯異常，6h時可見小腸絨毛損傷，但是部分絨毛上皮細胞有修復，部分腸管杯狀細胞分泌亢進，12h修復明顯，24h基本修復或正常，72h修復完全或正常。 二、各實驗組幼鼠血清和回腸組織SOD、M

9、DA及MPO含量的變化 (一)血清和回腸組織SOD活性變化LPS組血清SOD活性在6h、12h和24h與對照組比較有顯著降低(P<0.05)，雙歧桿菌組SOD活性在2h、6h、12h及24h與LPS組比較有顯著升高(P<0.05)。 LPS組回腸組織SOD活性在6h、12h和24h與對照組比較有顯著降低(P<0.05)，雙歧桿菌組SOD活性在6h和12h與LPS組比較有顯著升高(P<0.05)。 (二)血清和回腸

10、組織MDA含量變化LPS組血清MDA含量在6h、12h和24h與對照組比較有顯著增加(P<0.05)，雙歧桿菌組MDA含量在6h、12h及24h與LPS組比較有顯著下降(P<0.05)。 LPS組回腸組織MDA含量在6h、12h和24h與對照組比較有顯著增加(P<0.05)，雙歧桿菌組MDA含量在12h和24h與LPS組比較有顯著降低(P<0.05)。 (三)血清和回腸組織MPO含量變化LPS組血清MPO含量在6h、12

11、h和24h與對照組比較有顯著增加(P<0.05)，雙歧桿菌組MPO含量在6h和12h與LPS組比較有顯著降低(P<0.05)LPS組回腸組織MPO含量在2h、6h和12h與對照組比較有顯著增加(P<0.05)，雙歧桿菌組MPO含量在6h和12h與LPS組比較有顯著下降(P<0.05) 三、各實驗組幼鼠回腸組織Defensin-5、IGF-1和ICAM-1的分子生物學變化 (一)回腸組織Defensin-5 mRNA的表

12、達對照組回腸有少量Defensin-5 mRNA的表達，而模型組在LPS注射后2h表達明顯增加，6h達高峰，以后各時問點的表達逐漸下降，在2h、6h及12h與對照組有顯著性差異(P<0.05)；雙歧桿菌組Defensin-5的表達在LPS注射后2h較模型組下降，6h、12h及24h下降明顯(P<0.05)。雙歧桿菌組與對照組比較，在2h和6h均比對照組增加，其中在2h差異明顯(P<0.05)，以后逐漸下降至正常。 (二)回腸組織

13、IGF-1蛋白和mRNA表達 1、回腸組織IGF-1蛋白表達對照組各個時間點均有一定的IGF-1表達，表現(xiàn)為腸黏膜隱窩及上皮細胞較多量棕褐色顆粒；內(nèi)毒素組IGF-1表達較對照組在各個時間點均減少，以12、24和72h為著(P<0.05)，雙歧桿菌治療組IGF-1表達在6h開始較內(nèi)毒素組增加，以12、24和72h為著(P<0.05)，雙歧桿菌組在6、12和24h表達較對照組增多，但無統(tǒng)計學上意義。 2、回腸組織IGF-1

14、mRNA的表達對照組各時間點回腸有較多量的IGF-1mRNA表達；內(nèi)毒素組回腸IGF-1mR/NA表達較對照組減少，以6、12、24和72h為著(P<0.05)；雙歧桿菌治療組回腸IGF-1mRNA表達從6h以后較內(nèi)毒素組增加明顯(P<0.05)，其中12和24h較對照組增加，但沒有統(tǒng)計學上意義。 (三)回腸組織ICAM-1蛋白和mRNA表達 1、回腸組織ICAM-1蛋白表達回腸ICAM-1的免疫組織化學染色結(jié)果顯示：對

15、照組小腸黏膜間質(zhì)可見少量棕黃色顆粒，模型組小腸黏膜間質(zhì)均有棕黃色顆粒，以6h為著，免疫組織化學平均光密度值在6h、12h、24h和72h均較對照組有顯著性差異(P<0.01)，雙歧桿菌組小腸黏膜間質(zhì)棕黃色顆粒與模型組比較先增加而后逐漸減少，在6h和12h光密度值較模型組增加(P<0.01)，以后逐漸下降，在72h低于模型組(P<0.01)，而與對照組則無顯著性差異。 2、回腸組織ICAM-1 mRNA的表達對照組回腸有少量IC

16、AM-1 mRNA的表達，而模型組在LPS作用2h后表達明顯增加(P<0.01)，以后各時間點與對照組無顯著性差異；雙歧桿菌組在注射LPS 2h較模型組表達下降(P<0.01)而與對照組無顯著性差異，在6h和12h表達較模型組明顯增加(P<0.01)，24h下降明顯，與對照組和模型組比較均有顯著性差異(P<0.01)，72h回升至正常。 結(jié)論 1.、雙歧桿菌能減輕內(nèi)毒素損傷幼鼠的回腸組織病理學改變，并能促進組織損傷的修復

17、。 2、內(nèi)毒素損傷幼鼠血清和回腸組織SOD活性降低、MDA含量增加，雙歧桿菌能增加SOD活性，同時降低MDA含量，表明雙歧桿菌能通過抑制脂質(zhì)過氧化損傷而對幼鼠有一定的保護作用。 3、內(nèi)毒素損傷幼鼠血清和回腸MPO含量增加，同時回腸組織ICAM-1蛋白質(zhì)和mRNA表達增加，外源性給予雙歧桿菌能降低內(nèi)毒素組MlPO和ICAM-1的增加，表明雙歧桿菌能通過抑制大鼠體內(nèi)的MPO含量和ICAM-1的表達而保護腸道。 4、內(nèi)