德國進(jìn)境馬鈴薯有害生物風(fēng)險(xiǎn)分析以及RT-PCR病毒檢測技術(shù)的研究.pdf

1、馬鈴薯是世界性高產(chǎn)作物，我國的種植面積和產(chǎn)量居世界第一位，但其品質(zhì)和單產(chǎn)水平確是遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他馬鈴薯生產(chǎn)先進(jìn)的國家。我國急需從馬鈴薯生產(chǎn)先進(jìn)的國家引進(jìn)優(yōu)質(zhì)的馬鈴薯種薯來提高我國馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)。按照國際慣例，從境外引種前必須進(jìn)行有害生物風(fēng)險(xiǎn)分析，以保護(hù)我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生態(tài)安全。馬鈴薯病毒病是馬鈴薯生產(chǎn)中的重要制約因素，脫毒種薯的推廣是控制馬鈴薯病毒的主要方法。引進(jìn)種馬鈴薯種薯的質(zhì)量鑒定和脫毒種薯的生產(chǎn)都要求建立快速，準(zhǔn)確，靈敏的病毒檢測

2、方法。本研究通過德國進(jìn)境馬鈴薯的有害生物風(fēng)險(xiǎn)分析對引種德國馬鈴薯進(jìn)行了合理的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測，并確立了科學(xué)有效的風(fēng)險(xiǎn)管理措施，將引種風(fēng)險(xiǎn)降到最低；同時(shí)建立了同步檢測多種馬鈴薯病毒的多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(M-RT-PCR)檢測體系，為引種馬鈴薯質(zhì)量的鑒定和脫毒種薯的生產(chǎn)提供快速、準(zhǔn)確、靈敏、規(guī)范的病毒檢測技術(shù)。 1、德國進(jìn)境馬鈴薯種薯的有害生物風(fēng)險(xiǎn)分析分為3個(gè)階段 (1)開始階段：根據(jù)FAO制定的《有害生物風(fēng)險(xiǎn)分析準(zhǔn)則》，從傳

3、播途徑開始進(jìn)行有害生物風(fēng)險(xiǎn)分析，確定德國進(jìn)境馬鈴薯種薯上的有害生物共有179種。 (2)風(fēng)險(xiǎn)評估：再根據(jù)有害生物的地理分布、經(jīng)濟(jì)重要性、種薯傳帶的可能性等綜合指標(biāo)進(jìn)行初步評估，篩選出德國進(jìn)境馬鈴薯種薯限定的有害生物(RP)和非限定有害生物(NRP)。對RP根據(jù)其傳入、定殖、擴(kuò)散的可能性以及潛在的影響進(jìn)行詳細(xì)的風(fēng)險(xiǎn)評估，確定德國進(jìn)境馬鈴薯上潛在的檢疫性有害生物(QP)21種和限定的非檢疫性有害生物(RNQP)19種。 (3

4、)風(fēng)險(xiǎn)管理：根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)分析中的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子制定出將引種風(fēng)險(xiǎn)降低到可接受水平的風(fēng)險(xiǎn)管理措施并對每種風(fēng)險(xiǎn)管理措施進(jìn)行了效率評價(jià)。 2、RT-PCR技術(shù)檢測馬鈴薯病毒的研究 (1)RT-PCR反應(yīng)引物的設(shè)計(jì)：根據(jù)NCBI報(bào)道的病毒全基因組序列設(shè)計(jì)了PVA特異性引物對，根據(jù)病毒衣殼蛋白區(qū)序列設(shè)計(jì)了PVY和PLRV特異性引物對。采用單重、雙重和多重RT-PCR對這3種馬鈴薯病毒進(jìn)行了擴(kuò)增，擴(kuò)增片斷大小分別為400bp(PVY)、30

5、0bp(PVY)和222bp(PLRV)。 (2)馬鈴薯病毒RNA制備：采用了LiCl法、試劑盒法和浸提法3種方法提取馬鈴薯病毒RNA，結(jié)果表明LiCl法和試劑盒法提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測其純度高且完整性較好，浸提法提取得的RNA其純度和完整性不及其他兩種方法，但3種方法提取的RNA均能符合RT-PCR的要求。 (3)RT-PCR體系的建立：試驗(yàn)從反轉(zhuǎn)錄、PCR等方面對單重、雙重和多重RT-PCR體系檢測馬鈴薯種病毒

6、進(jìn)行了探索和優(yōu)化。結(jié)果表明反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中dNTPs濃度以及PCR反應(yīng)中Mg2+濃度對RT-PCR體系檢測PPVY、PVA和PLRV有較大的影響。優(yōu)化后的多重RT-PCR反應(yīng)體系可以同步檢測這3種馬鈴薯病毒。 (4)擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性驗(yàn)證：切膠回收PVY、PVA和PLRV擴(kuò)增產(chǎn)物，分別克隆到PGM-T載體上，白色陽性菌落通過PCR驗(yàn)證表明PVY、PVA和PLRV的cDNA成功的轉(zhuǎn)入了大腸桿菌中，提取質(zhì)粒測序，經(jīng)用NCBIBIAST比對