農桿菌介導的香菇遺傳轉化體系構建.pdf

1、香菇(Lentinula edodes)是廣泛種植的食用菌之一，隨著其基因組測序的完成，功能基因組學研究將逐漸展開。遺傳轉化體系是基因功能研究的基礎，其中農桿菌介導的轉化方法有著插入拷貝數少、穩(wěn)定高效等優(yōu)點。本研究采用農桿菌介導轉化法構建了一套適用于香菇的遺傳轉化體系。
　　 首先從香菇菌株武香1號(W1)中克隆得到gpd啟動子，以質粒pCAMBIA1301為骨架，替換掉HYG基因前的啟動子CaMV35S，構建了一個新的轉化載體

2、pCAMBIA1301-gpd。再將載體pCAMBIA1301-gpd和pCAMBIA1301分別導入農桿菌EHA105，在乙酰丁香酮(AS)存在的條件下，農桿菌EHA105與香菇菌株W1和L205菌絲體分別共培養(yǎng)3d。經ddH2O清洗香菇菌絲后，在含有潮霉素和抗生素的平皿上篩選轉化子，PCR檢測排除假陽性干擾。轉化子在麥芽浸膏培養(yǎng)基(MYG)上繼代培養(yǎng)5輪后，仍能在含潮霉素的平皿上穩(wěn)定生長。
　　 不同啟動子對不同受體菌株的潮

3、霉素篩選效率統(tǒng)計顯示，當載體pCAMBIA1301-gpd轉化香菇菌株W1時，潮霉素篩選效率最高，達到30%左右。其中啟動子為gpd時的潮霉素篩選效率是啟動子為CaMV35S時的兩倍，由此說明，組成型內源啟動子對香菇表達外源基因有很強的啟動作用。受體菌株W1的潮霉素篩選效率要略高于菌株L205，這可能與受體菌株的遺傳背景有關。
　　 本試驗還對共培養(yǎng)的條件進行了優(yōu)化，從農桿菌侵染時間、共培養(yǎng)溫度、共培養(yǎng)時間，以及在共培養(yǎng)過程中是

4、否需要添加乙酰丁香酮等4個方面展開。結果表明，農桿菌侵染10 min、20 min、30 min對潮霉素篩選效率的影響并不明顯，共培養(yǎng)最適溫度為25℃，共培養(yǎng)3d和4d的潮霉素篩選效率差別不大，而共培養(yǎng)2d則不能很好的完成轉化；共培養(yǎng)期間添加乙酰丁香酮，對轉化子的生長十分必要。
　　 本試驗構建的香菇遺傳轉化體系，為今后香菇基因重組、基因沉默、基因超量表達、插入突變等基因功能的研究奠定了基礎，也為香菇生長發(fā)育機制研究提供了重要的