心臟發(fā)育相關(guān)基因ALK3及其下游基因Pax-8的實驗研究.pdf

1、目的： 在心臟特異性骨形態(tài)形成蛋白受體ⅠA(the bone morphogenetic protein receptorⅠ A，BMPRⅠ A，又名ALK3)基因敲除的小鼠模型中，純合子死于胚胎中期，同時伴有室間隔缺損(ventricular septal defect，VSD)。因此，分析ALK3及其下游基因Pax-8的表達(dá)對于探索心臟發(fā)育的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及研究室間隔缺損與心肌細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系意義重大。 方法：

2、 體內(nèi)實驗中，由20只雌性α-MHC Cre+/-，ALK3+/-小鼠與20只雄性ALK3F/F小鼠交配得到心臟特異性ALK3基因敲除的純合子小鼠(α-MHC Cre+/-，ALK3 F/-)與雜合子小鼠(α-MHC Cre+/-，ALK3 F/+)；由雌性與雄性Pax-8 KO+/-小鼠各10只交配得到Pax-8基因敲除的純合子小鼠(Pax-8 KO-/-)與雜合子小鼠(Pax-8 KO+/-)；由雌性與雄性C57d，鼠各10只交

3、配得到野生型小鼠(C57)。提取組織DNA，行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)鑒定小鼠基因型。通過光學(xué)顯微鏡與透射電子顯微鏡觀察ALK3和Pax-8基因敲除小鼠心臟組織細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)。使用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUN

4、EL)檢測心肌細(xì)胞的凋亡情況。采用高頻超聲技術(shù)觀察Pax-8基因敲除的純合子小鼠與雜合子小鼠的心臟結(jié)構(gòu)、功能和血流動力學(xué)指標(biāo)。體外實驗中，大鼠胚胎心肌細(xì)胞株(H9C2(2-1))轉(zhuǎn)染針對Pax-8基因的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，以反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcript-polymerase chain reaction，RT-PCR)和Western blot檢測干擾效率，

5、通過觀察細(xì)胞凋亡蛋白酶(caspase-3)活性評估細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果： 光鏡顯示ALK3和Pax-8基因敲除的純合子小鼠存在VSD現(xiàn)象。透射電鏡提示ALK3和Pax-8基因敲除的純合子小鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的病理改變較雜合子及野生型小鼠嚴(yán)重。TUNEL法表明ALK3和Pax-8基因敲除的純合子小鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(cardiac myocyte apoptosis index，CMAI)較雜合子及野生型小鼠高(P<0.

6、01)。高頻超聲心動圖提示Pax-8基因敲除的純合子小鼠與雜合子小鼠相比，左室內(nèi)徑(P<0.01)、二尖瓣血流峰值(P<0.01)和二尖瓣血流E/A比值(P<0.05)減小，左室射血分?jǐn)?shù)(P<0.05)和縮短分?jǐn)?shù)(P<0.05)增加。RNA干擾(RNA interference，RNAi)后，Pax-8 siRNA組的Pax-8 mRNA表達(dá)水平較陰性對照組和空白對照組分別下調(diào)60.30％(P<0.05)和63.09％(P<0.05)，

7、Pax-8蛋白質(zhì)表達(dá)水平較陰性對照組和空白對照組分別下調(diào)50.38％(P<0.05)和54.17％(P<0.05)，陰性對照組與空白對照組Pax-8 mRNA(P>0.05)和蛋白質(zhì)(P>0.05)表達(dá)無顯著差異；Caspase-3活性測定中，Pax-8 siRNA組A405nm為0.179±0.075，較陰性對照組0.081±0.018(P<0.01)和空白對照組0.078±0.016(P<0.01)明顯升高。 結(jié)論：