ALK3基因?qū)ε哐垡暰W(wǎng)膜與晶狀體相互誘導(dǎo)作用的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 提高人口質(zhì)量,避免缺陷患兒出生,治療先天性疾病已成為國人關(guān)注的焦點(diǎn)。分子遺傳學(xué)一基因組學(xué)的迅速發(fā)展,促進(jìn)了分子醫(yī)學(xué)時(shí)代的到來,推動(dòng)了多種復(fù)雜疾病致病基因的發(fā)現(xiàn)及其發(fā)病分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)。對(duì)于絕大多數(shù)遺傳性眼病,目前臨床上尚無真正有效可以逆轉(zhuǎn)或者延緩其發(fā)生的治療手段,盡管先天性白內(nèi)障可以通過及早手術(shù)治療使白內(nèi)障盲得到不同程度的恢復(fù),但由于嬰幼兒視覺系統(tǒng)的特殊性,如眼球仍在發(fā)育,屈光狀態(tài)不穩(wěn)定,術(shù)后炎癥反應(yīng)重等,都大大增加

2、了手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)和難度,另外術(shù)后弱視的治療及對(duì)患兒的護(hù)理水平都與預(yù)后密切相關(guān),就我國而言目前先天性白內(nèi)障術(shù)后的復(fù)明率及脫殘率并不容樂觀,而且即使患兒可以獲得高質(zhì)量的手術(shù),但是隨之而帶來的國家及家庭的財(cái)政支出極為龐大。由于目前對(duì)于絕大多數(shù)遺傳性眼病尚無有效治療方法,多以保守治療、藥物治療并附以手術(shù)治療為主,這不僅給患者及其家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān),也無法采取有效的遺傳干預(yù)杜絕疾病對(duì)后代的威脅。因此闡釋遺傳性眼病的發(fā)病機(jī)制非常重要,這對(duì)于在

3、一定程度上預(yù)防或者延緩其發(fā)展具有重大而深遠(yuǎn)的意義。本課題通過對(duì)ALK3基因在晶體內(nèi)條件敲除小鼠的研究從蛋白及分子生物學(xué)水平對(duì)胚胎發(fā)育過程中,ALK3對(duì)視網(wǎng)膜與晶狀體之間相互誘導(dǎo)作用的影響及機(jī)制做深入的闡述。
　　 材料和方法：
　　 脊椎動(dòng)物眼的發(fā)育需要晶狀體和視網(wǎng)膜組織之間的相互誘導(dǎo)作用,這種相互誘導(dǎo)作用需要一定的信號(hào)傳導(dǎo)途徑,在胚胎發(fā)育過程中,Alk3是BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上重要的受體,它的缺失可以導(dǎo)致眼部發(fā)育的異常,

4、探討它在晶體區(qū)的條件缺失對(duì)晶體的發(fā)育產(chǎn)生的誘導(dǎo)作用以及對(duì)視網(wǎng)膜組織的發(fā)育產(chǎn)生的影響。通過這些觀察對(duì)胚胎發(fā)育過程中晶狀體和視網(wǎng)膜組織之間相互誘導(dǎo)作用的機(jī)制做進(jìn)一步的闡述。本實(shí)驗(yàn)采用Alk3受體在晶體內(nèi)條件敲除的小鼠,Alk3fl/fl;LeCre,Alk3fl/+;LeCre。母鼠alk3fl/fl配公鼠lecrealk3fl/+;或者母鼠alk3fl/+配公鼠lecrealk3fl/fl,產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)組:50%lecrealk3fl/fl,

5、對(duì)照組:50%lecrealk3fl/+。ALK3基因敲除小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室里,采用1只雄鼠與2只雌鼠同居的方式進(jìn)行繁殖。進(jìn)行鼠尾DNA的提取,然后基因型鑒定,取胚胎,DEPC-PBS洗兩次,4%PFA固定,過夜(把胎鼠的編號(hào)標(biāo)好,取鼠尾做PCR),石蠟包埋,然后HE染色。免疫熒光檢查,一抗是sc-9305bmp7(santacruzUS),二抗是IF-0314aGOIgG/FITC(santacruzUS),石蠟切片常規(guī)脫蠟

6、:二甲苯5分鐘×3次,100%乙醇5分鐘2次,90%乙醇2分鐘,70%乙醇2分鐘,40%乙醇2分鐘,PBS5分鐘:枸櫞酸緩沖洗,微波抗原修復(fù);蒸餾水沖洗,PBS浸泡3分鐘×2次,4%過氧化氫室溫孵育20分鐘以清除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,PBS浸泡3分鐘×2次;正常羊血清室溫孵育20分鐘,封閉非特異性抗原;吸去羊血清,然后加入一抗,4℃孵育過夜;PBS洗3次,加入二抗,避光孵育1h,PBS洗3次;磷酸甘油封片,熒光鏡下觀察。原位雜交實(shí)驗(yàn),

7、BMP4原位雜交試劑編號(hào)為MK1784-m(BOSTER),滅活內(nèi)源性酶:加3%H2O2水于組織切片上,室溫10分鐘,以滅活內(nèi)源性酶,蒸餾水洗;暴露mRNA核酸片斷:切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶,37℃或室溫消化15分鐘,PBS洗3次x5分鐘,蒸餾水洗1次;后固定:加1%多聚甲醛室溫固定10分鐘,蒸餾水洗3次;預(yù)雜交:每切片加20μL預(yù)雜交液,濕盒中42℃2-4h。吸棄多余液體,不洗;雜交:每切片加20μL雜交液,將硅化蓋玻片

8、置于切片上,濕盒中42℃16-20h;雜交后洗滌;封閉:滴加封閉液,37℃30分鐘。甩去多余液體,不洗;標(biāo)記:滴加生物素化鼠抗地高辛,37℃60分鐘。PBS洗5分鐘x4;SABC:滴加SABC,37℃20分鐘。PBS洗5分鐘×3;二抗:滴加生物素化過氧化酶,37℃20分鐘。PBS洗5分鐘×4;DAB顯色;復(fù)染;脫水透明;封片。
　　 結(jié)果：
　　 ALK3在晶體的發(fā)育過程中起重要的調(diào)節(jié)作用,但ALK3的缺失并不會(huì)導(dǎo)致晶體

9、發(fā)育的缺失。在ALK3晶體內(nèi)條件敲除的小鼠與對(duì)照組的比較中,晶體的形態(tài)學(xué)變化差異從E13.5d開始可以分辨,在E15.5d已經(jīng)發(fā)生了顯著性的差異,但實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均有晶體的發(fā)育。BMP7在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)于晶體中,而且其表達(dá)受ALK3的影響。在ALK3晶體內(nèi)條件敲除的小鼠,BMP4,BMP7在晶體內(nèi)的表達(dá)顯著減少,尤其在胚胎發(fā)育的中后期(E13.5d-E15.5d);而在對(duì)照組中BMP,4,BMP7的表達(dá)則不受影響。ALK3在晶體內(nèi)條

10、件敲除可以影響視網(wǎng)膜的發(fā)育,但不會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜的不發(fā)生,在ALK3晶體內(nèi)條件敲除的小鼠與對(duì)照組的比較中,視網(wǎng)膜的形態(tài)學(xué)變化差異從E13.5d開始出現(xiàn),在E15.Sd有了顯著性的差異,明顯出現(xiàn)了視網(wǎng)膜厚度和分化的不同,但實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均有視網(wǎng)膜的形成發(fā)生。BMP7在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)于視網(wǎng)膜中,當(dāng)ALK3在晶體內(nèi)條件敲除后,BMP7在視網(wǎng)膜內(nèi)的表達(dá)也受到影響。在ALK3晶體內(nèi)條件敲除的小鼠中,BMP7在視網(wǎng)膜內(nèi)的表達(dá)顯著減少,尤其在胚胎發(fā)育

11、的中后期(E13.5d-E15.5d);而在對(duì)照組中BMP7的表達(dá)則不受影響。這說明了胚胎發(fā)育過程中晶體組織對(duì)視網(wǎng)膜的發(fā)育具有調(diào)節(jié)作用。
　　 結(jié)論：
　　 ALK3在晶體和視網(wǎng)膜的發(fā)育過程中起重要的調(diào)節(jié)作用,但ALK3的缺失并不會(huì)導(dǎo)致晶體、視網(wǎng)膜發(fā)育的缺失。ALK3晶體內(nèi)條件敲除的小鼠隨著胚齡的增加,晶體的形態(tài)學(xué)變化日益明顯,雖然有晶體的發(fā)育,但發(fā)育不良、形態(tài)缺陷明顯。BMP7在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)于晶體和視網(wǎng)膜中,而且