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文檔簡介
1、目的:在心臟特異的骨形態(tài)形成蛋白受體IA(thebonemorphogeneticproteinreceptorIA,又名ALK3)基因敲除小鼠模型中,純合子的心臟特異ALK3基因敲除的小鼠死于胚胎中期,同時(shí)伴有室間隔缺損。但是,ALK3不是心臟的特異基因,為了探索室間隔缺損的特異相關(guān)基因,使用基因芯片(microarray)的方法篩選了ALK3下游基因-轉(zhuǎn)錄因子Pax-8。運(yùn)用Pax-8基因敲除的小鼠動(dòng)物模型,以發(fā)現(xiàn)Pax-8基因敲除
2、后小鼠心臟發(fā)育和功能的異常。 方法:取正常雌雄C57小鼠交配后的孕9.5天,10.5天,11.5天,12.5天以及13.5天的小鼠胚胎心臟提取總RNA,運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測Pax-8基因在正常小鼠胚胎中的表達(dá)情況。雌的α-MHCCre+/-,ALK3+/-和雄的ALK3F/F(在ALK3基因第二外顯子兩邊插入LoxP的片段)交配可獲得α-MHCCre+/-,ALK3F/-(純合子)和α-MHCCre+/-,ALK3
3、F/+(雜合子)的小鼠胚胎,運(yùn)用原位雜交法顯示Pax-8基因在小鼠胚胎心臟中的表達(dá)部位。雌的Pax-8KO+/-和雄的Pax-8KO+/-交配可獲得Pax-8KO-/-(純合子)和Pax-8KO+/-(雜合子),TUNEL法可以檢測心肌細(xì)胞在不同實(shí)驗(yàn)組的凋亡情況,同時(shí)電鏡下觀察Pax-8基因敲除的小鼠心臟組織發(fā)育的病理學(xué)異常。 結(jié)果:熒光定量RF-PCR結(jié)果顯示,正常孕9.5天,10.5天,11.5天,12.5天以及13.5天的
4、胚胎小鼠心臟中的Pax-8基因的表達(dá)水平以10.5天最高,12.5天表達(dá)為最低。同時(shí)原位雜交顯示Pax-8基因表達(dá)在α-MHCCre+/-,ALK3F/+(雜合子)13.5天的小鼠胚胎的心臟,但不能在13.5天α-MHCCre+/-,ALK3F/-(純合子)小鼠心臟中顯示。對Pax-8基因敲除小鼠的心臟的研究顯示其表現(xiàn)出晚期心功能不全的形態(tài)改變,光鏡下Pax-8KO-/-(純合子)心臟四腔心切片HE染色后形態(tài)與Pax-8KO+/-(雜合
5、子)比較,Pax-8KO-/-心臟成球形,左心室腔擴(kuò)大,左心室壁肥厚,室間隔增厚,左室乳頭肌肥大,Pax-8KO+/-小鼠心臟形態(tài)尚正常。透射電鏡下Pax-8KO-/-小鼠心肌左心室壁以及室間隔組織的肌絲肌節(jié)排列尚整齊,肌漿網(wǎng)擴(kuò)張,可見大量的凋亡心肌細(xì)胞,凋亡程度較重,細(xì)胞染色質(zhì)濃集和邊移,形成凋亡小體,細(xì)胞固縮而細(xì)胞膜完整,胞漿空泡,線粒體數(shù)量明顯增多,體積明顯減小。Pax-8KO+/-小鼠心肌左心室和室間隔組織肌絲肌節(jié)排列尚整齊,肌
6、漿網(wǎng)未見明顯擴(kuò)張,可見中等量的凋亡心肌細(xì)胞,線粒體大小數(shù)量未見明顯異常。野生型C57小鼠肌絲肌節(jié)排列尚整齊,肌漿網(wǎng)未見明顯擴(kuò)張,可見極少量的凋亡心肌細(xì)胞,線粒體大小形態(tài)正常。TUNEL法測定心肌細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示,Pax-8KO-/-(純合子)心肌細(xì)胞凋亡率為50.6932±5.36665%,Pax-8KO+/-(雜合子)心肌細(xì)胞凋亡率25.4724±5.61390%,C57野生型小鼠心肌細(xì)胞凋亡率為2.9472±0.64102%。
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