Hck基因與胚胎心臟發(fā)育及NFATc1基因與心臟發(fā)育缺陷關(guān)系的研究.pdf

1、第一部分 目的：探討Hck基因在大鼠胚胎心臟發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)規(guī)律、過表達(dá)Hck基因?qū)19向心肌細(xì)胞分化的影響及過表達(dá)Hck對(duì)工具細(xì)胞功能的影響，從而分析其與心臟發(fā)育的關(guān)系。 方法：1)取大鼠胚胎12、15、19d心臟，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)心臟組織中Hck基因mRNA的表達(dá)豐度，并應(yīng)用原位雜交技術(shù)對(duì)Hck基因表達(dá)進(jìn)行定位分析。2)構(gòu)建Hck真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入P19細(xì)胞，篩選穩(wěn)定表達(dá)株并進(jìn)行DMSO誘導(dǎo)分化方案誘導(dǎo)

2、其向心肌細(xì)胞分化，在誘導(dǎo)的第10天觀察心肌細(xì)胞的跳動(dòng)并抽提細(xì)胞總蛋白，用Western-b1ot方法檢測(cè)cTnI的表達(dá)。3)構(gòu)建p56Hck及其突變體的熒光表達(dá)載體，并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，進(jìn)行F-actin染色及微管蛋白免疫組化，或應(yīng)用Phagokinetic track motility assay及體外侵蝕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HeLa細(xì)胞遷移及侵襲能力的變化。 結(jié)果：1)在胚胎12、15、19d心臟中，Hck基因均有表達(dá)，但主要表達(dá)于

3、心臟間質(zhì)，在心肌細(xì)胞中不表達(dá)，其表達(dá)隨胚齡增加呈逐漸上調(diào)趨勢(shì)(P<0.05)。2)在P19分化第10天，相差顯微鏡下觀察Hck轉(zhuǎn)染組跳動(dòng)的心肌細(xì)胞集落的數(shù)目及面積未有變化，Hck轉(zhuǎn)染組cTnI的表達(dá)量與對(duì)照組無顯著區(qū)別(P>0.05)。3)過表達(dá)p56Hck/p56Hckca能促使HeLa細(xì)胞細(xì)胞膜突起增多、F-actin及細(xì)胞微管蛋白的重新分布，并促進(jìn)HeLa細(xì)胞的遷移及侵襲能力增強(qiáng)。 結(jié)論：Hck基因表達(dá)于心臟間質(zhì)而在心肌細(xì)

4、胞中無表達(dá)，其表達(dá)豐度與大鼠胚胎心臟發(fā)育時(shí)間有關(guān)；Hck的過表達(dá)并不影響P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化；Hck基因功能可能與心臟間質(zhì)細(xì)胞的遷移黏附等功能相關(guān)，Hck功能缺陷可能通過影響心臟間質(zhì)細(xì)胞的功能而導(dǎo)致先天性心臟病的發(fā)生。 第二部分 NFATcl基因與心臟發(fā)育缺陷關(guān)系的研究 目的：探討NFATcl敲除導(dǎo)致小鼠心臟瓣膜及室間隔缺陷的具體原因及在心臟發(fā)育中受NFATcl調(diào)控的下游分子。 方法：1)取經(jīng)genotypi

5、ng驗(yàn)證的E9.5-E13.5 NFATcl敲除小鼠和野生型小鼠，固定、包埋、切片后應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)凋亡因子Caspase3，細(xì)胞增殖標(biāo)志蛋白PCNA、K167，及FGFR1、RGS10的表達(dá)；2)分離并原代培養(yǎng)小鼠胚胎E11.5心內(nèi)膜細(xì)胞(ECC)，應(yīng)用CSA、FK506分別抑制或應(yīng)用PMA+ionomycin激活ECC細(xì)胞中Cacinurin-NFATcl通路后來研究對(duì)FGFR1、RGSl0表達(dá)的影響；3)預(yù)測(cè)并克隆FGFR1的

6、內(nèi)含子區(qū)域NFATcl結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建成Luciferase報(bào)告基因系統(tǒng)載體，與NFATcl真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染MEF細(xì)胞，分別在培養(yǎng)基含或不含ionomycin的情況下測(cè)定熒光素酶活性。 結(jié)果：1)相對(duì)于野生型小鼠，NFATcl敲除小鼠心臟開始出現(xiàn)凋亡的時(shí)間并無提前，二者均于E12.5開始在心臟發(fā)育中的內(nèi)膜墊區(qū)域出現(xiàn)凋亡，主要位于室間隔膜部及瓣膜位置并在E13.5凋亡達(dá)到高峰。然而NFATcl敲出小鼠的凋亡程度重于野生型；2)NF

7、ATcl敲除小鼠胚胎心臟增殖減弱表現(xiàn)在瓣膜形成期，主、肺瓣膜內(nèi)膜細(xì)胞缺乏增殖能力；3)FGFR1在NFATcl敲除小鼠胚胎心臟發(fā)育過程中出現(xiàn)兩次下調(diào)，第一次表達(dá)的下調(diào)發(fā)生于E10.5，主要集中于動(dòng)脈干及心內(nèi)膜墊區(qū)域；第二次表達(dá)的下調(diào)發(fā)生于E13.5，只位于心臟瓣膜。FGFRl的內(nèi)含子區(qū)域存在著一個(gè)NFATcl的結(jié)合位點(diǎn)。應(yīng)用CSA、FK506分別抑制ECC細(xì)胞中Cacinurin-NFATcl通路后FGFR1的表達(dá)下調(diào)；應(yīng)用PMA+io

8、nomycin激活ECC細(xì)胞中Cacinurin-NFATcl通路后FGFRl的表達(dá)上調(diào)。4)RGSl0在NFATcl-1-小鼠心內(nèi)膜細(xì)胞的表達(dá)增強(qiáng)；在NFATcl表達(dá)減少的ECC細(xì)胞，RGS10表達(dá)顯著上調(diào)；而在NFATcl表達(dá)增多的ECC細(xì)胞，RGS10表達(dá)顯著下調(diào)。抑制ECC細(xì)胞中NFATcl活性會(huì)引起RGS10 mRNA的表達(dá)上調(diào)；而激活NFATcl活性導(dǎo)致RGS10 mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)。 結(jié)論：NFATcl基因敲除