老年人頸動脈不穩(wěn)定斑塊差異表達譜分析及差異基因驗證研究.pdf

1、背景：
　　在全球范圍內(nèi)，心血管疾病是危害人類健康的主要疾病。在致殘致死的心血管疾病中，75％以上是由動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)引起，故As是心腦血管疾病發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)。目前普遍認為As是一種慢性、進展性、炎癥性疾病，而明確As的發(fā)病機制是防治心腦血管病的根本措施。動脈粥樣硬化斑塊的形成是一個復(fù)雜而漫長的過程，目前認為該病理過程由多種因子參與，而炎癥反應(yīng)貫穿動脈硬化發(fā)生發(fā)展的全過程。在大量的細胞因子作

2、用下，內(nèi)皮細胞發(fā)生損傷，內(nèi)皮細胞通透性下降，單核細胞穿透內(nèi)皮層進入內(nèi)皮下形成巨噬細胞，巨噬細胞在血管內(nèi)膜吞噬脂滴形成泡沫細胞，平滑肌細胞大量增殖并合成大量的細胞外基質(zhì)，形成了一個由脂紋、纖維斑塊、粥樣斑塊到斑塊破裂的復(fù)合病變過程。
　　臨床病例觀察發(fā)現(xiàn)，動脈狹窄的程度與急性心腦血管事件如急性冠狀動脈綜合征、急性缺血性腦卒中等發(fā)生并不成平行關(guān)。越來越多的研究表明，急性心腦血管事件的發(fā)生不僅取決于動脈管腔的狹窄程度，更重要的決定因素是

3、動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的形成。不穩(wěn)定斑塊即出現(xiàn)破裂的斑塊，又稱易損斑塊，其病理特征主要為膠原含量減少，平滑肌細胞減少，炎癥細胞廣泛浸潤，較薄的偏心性纖維帽，較大脂質(zhì)核心，斑塊表面裂隙，斑塊內(nèi)出現(xiàn)新生血管，斑塊內(nèi)出血、鈣化等。不穩(wěn)定斑塊引起的斑塊破裂、血栓形成和血管腔阻塞是引起急性心腦血管事件的主因。明確不穩(wěn)定斑塊的發(fā)生機制對于預(yù)防急性心腦血管事件的發(fā)生具有十分重要的理論和臨床意義。目前，不穩(wěn)定斑塊形成的病理生理學機制主要包括斑塊內(nèi)炎癥反

4、應(yīng)的增加、新生血管形成和細胞大量凋亡，而誘導這些過程改變的分子機制并不完全清楚。
　　基因表達芯片技術(shù)可同時比較成千上萬個基因的表達變化，全面篩選某一表型或某一疾病的所有相關(guān)基因，還可揭示不同基因表達變化之間的相互關(guān)系，從而為研究基因與基因之間的內(nèi)在聯(lián)系提供線索?；虮磉_譜分析技術(shù)應(yīng)用到動脈粥樣硬化領(lǐng)域已有14年的歷史。在這期間，國內(nèi)外研究學者基于芯片研究識別了許多動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中相關(guān)的重要基因和通路，對深入理解和全面認

5、識該疾病做出了巨大的貢獻。基因表達譜分析可以為動脈粥樣硬化機制研究提供一種全新的研究模式，為基礎(chǔ)研究提供潛在的思路和方向。目前雖然有較多的動脈粥樣硬化基因表達譜分析研究，但大多數(shù)研究在實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析方面存在一定的問題。首先，樣本選取不規(guī)范如不同來源和不同部位血管組織間分析比較會引入較多的混雜因素，影響分析結(jié)果的可信度;第二，樣本量過少，可能會影響到結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性。第三，動物模型與人的物種間差異可能會影響一些研究成果在臨床中的推

6、廣應(yīng)用，如適合動物的治療靶點未必在人體試驗中有效。第四，芯片數(shù)據(jù)分析過于簡單，沒有使用系統(tǒng)生物信息學分析，可能會遺漏芯片中的重要生物信息。所以，較大樣本規(guī)模的、相同來源的人體血管組織、同時經(jīng)過系統(tǒng)的生物信息學分析的研究仍然是十分缺乏和急需的。在本次研究中，通過ArrayExpress數(shù)據(jù)庫獲取不穩(wěn)定頸動脈粥樣硬化斑塊和穩(wěn)定頸動脈粥樣硬化斑塊間差異表達基因譜，并運用生物信息學方法分別在GO語義、KEGG通路和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中初步探索不穩(wěn)定斑

7、塊形成的分子機制，并在mRNA和蛋白水平驗證本次研究所獲取的疾病相關(guān)風險基因的差異程度，旨在尋找引起不穩(wěn)定斑塊發(fā)生的主要相關(guān)疾病基因和通路。這些為我們未來深入研究不穩(wěn)定斑塊發(fā)生機制、篩選心腦血管事件早期預(yù)警指標和尋找穩(wěn)定斑塊的生化指標和治療靶點提供理論指導。本研究共分為兩部分:1、差異基因表達譜獲取疾病相關(guān)基因及通路;2、在mRNA和蛋白水平上對疾病相關(guān)基因進行實驗驗證。
　　目的：
　　1、獲取不穩(wěn)定斑塊差異基因表達譜、疾

8、病相關(guān)基因和通路
　　2、在人體頸動脈不穩(wěn)定斑塊組織和穩(wěn)定斑塊組織中驗證TYROBP、CXCR4和VCL差異程度。
　　方法：
　　1、下載基因表達譜原始數(shù)據(jù)
　　從ArrayExpress數(shù)據(jù)庫中下載E-MTAB-2055數(shù)據(jù)集的原始文件后，分別對探針水平的信號值進行質(zhì)控、變異穩(wěn)定性分析、背景矯正、數(shù)據(jù)歸一化和基因注釋，最終轉(zhuǎn)化為基因水平的表達值。
　　2、獲取差異表達基因
　　應(yīng)用T檢驗和差異倍數(shù)

9、法(fold-change，F(xiàn)C)識別不穩(wěn)定斑塊和穩(wěn)定斑塊間差異表達基因譜。
　　3、差異表達基因功能富集分析
　　通過DAVID網(wǎng)站(Database for Annotation，Visualization and IntegratedDiscovery)提交基因表達譜獲取的差異表達基因，分別進行GO術(shù)語和KEGG通路富集分析。
　　4、構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)
　　從string（版本號9.1）網(wǎng)站下載人類所有的蛋

10、白互作關(guān)系列表，獲取差異表達基因在蛋白層面的互作網(wǎng)絡(luò)，將差異表達基因構(gòu)成的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)導入到Cytoscape（版本號2.8.2）進行網(wǎng)絡(luò)分析，查找疾病相關(guān)風險模塊(module)及風險基因。
　　5、獲取頸動脈不穩(wěn)定斑塊組織和穩(wěn)定斑塊組織
　　從南方醫(yī)院血管外科手術(shù)室收集頸動脈斑塊組織，彩色多普勒超聲分辨頸動脈斑塊性質(zhì)，選取有不穩(wěn)定斑塊特征并進行頸動脈環(huán)切術(shù)的患者納入本次研究，將手術(shù)切除連帶的斑塊旁組織作為對照斑塊（穩(wěn)定斑

11、塊）使用。
　　6、檢測人頸動脈血管組織（穩(wěn)定斑塊和不穩(wěn)定斑塊組織）中TYROBP、CXCR4和VCL在轉(zhuǎn)錄水平的表達情況。
　　7、檢測人頸動脈血管組織（穩(wěn)定斑塊和不穩(wěn)定斑塊組織）中TYROBP、CXCR4和VCL在蛋白水平的表達情況。
　　四、統(tǒng)計學處理
　　1、獲取差異表達基因使用T檢驗和FC方法。差異表達基因篩選閾值為p-value＜=0.01且|logFC|＞1。富集分析使用的統(tǒng)計學方法為超幾何檢驗，G

12、O富集篩選閾值為FDR＜=0.01，KEGG富集篩選閾值為p-value＜=0.05。
　　2、所有數(shù)據(jù)均代表3次以上重復(fù)實驗的結(jié)果，以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，所有統(tǒng)計分析由SPSS19.0統(tǒng)計軟件包進行處理，不穩(wěn)定斑塊與穩(wěn)定斑塊組織之間各個基因差異表達情況的比較采用Mann-whitney U檢驗統(tǒng)計分析。檢驗水準:α=0.05，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1、差異表達基因篩選結(jié)果
　　

13、本研究共獲取439個差異表達基因，其中上調(diào)基因232個，下調(diào)基因207個。差異表達上調(diào)基因倍比變化最大的基因是heme oxygenase1(HMOX1，logFC=3.1)，差異表達下調(diào)基因倍比變化最大的基因是alpha-actin(ACTC1，logFC=-2.2)。
　　2、差異表達基因功能富集分析結(jié)果
　　GO富集結(jié)果顯示免疫應(yīng)答、免疫防御、炎癥應(yīng)答、細胞粘附、細胞因子等富集顯著性最高。通路富集結(jié)果顯示溶酶體通路、細

14、胞因子信號通路、PPAR信號通路、細胞因子-細胞因子互作通路、白細胞跨膜遷移通路、補體凝血級聯(lián)反應(yīng)通路、造血細胞譜系和酪氨酸代謝通路等被顯著富集。
　　3、差異表達基因構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network，PPI)分析結(jié)果
　　在PPI網(wǎng)絡(luò)中，TYROBP、CTSS、C1QB、PLEK、IGSF6、HCK、VCL、LAPTM5、CXCR4和FCER1G在蛋白互作網(wǎng)中處于網(wǎng)絡(luò)

15、中心位置，在生物網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要作用，可能與本次研究的老年人頸動脈不穩(wěn)定斑塊發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。按風險模塊中基因數(shù)目不少于5個的閾值標準，本次研究共獲取了四個與不穩(wěn)定斑塊相關(guān)的風險子模塊，TYROBP、CXCR4、VCL和APOE分別占據(jù)四個模塊中心位置，在風險子模塊中發(fā)揮關(guān)鍵結(jié)點作用。
　　4、與穩(wěn)定斑塊組織相比，不穩(wěn)定斑塊組織中TYROBP、CXCR4在mRNA水平表達上調(diào)，采用Mann-whitney U檢驗顯示P＜0.05，差異

16、有統(tǒng)計學意義;VCL在不穩(wěn)定斑塊組織中表達下調(diào)，但無統(tǒng)計學意義。
　　5、與穩(wěn)定斑塊組織相比，不穩(wěn)定斑塊組織中TYROBP、 CXCR4在蛋白水平表達明顯增加;VCL在不穩(wěn)定斑塊組織中表達降低。
　　結(jié)論：
　　1、免疫和炎癥反應(yīng)在不穩(wěn)定斑塊發(fā)生中發(fā)揮重要作用;
　　2、差異基因表達譜分析顯示TYROBP和CXCR4表達下調(diào)，VCL表達上調(diào)，其可能在不穩(wěn)定斑塊形成過程中發(fā)揮作用;
　　3、在mRNA水平，C