AngⅡ通過(guò)經(jīng)典途徑及MEK途徑對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB活化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 目的:探討血管緊張素II(AngII)對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HPMEC)核因子-кB(NF-кB)的活性的影響,以及經(jīng)典途徑在AngII介導(dǎo)的NF-кB活化過(guò)程中的作用。 方法:本實(shí)驗(yàn)分為以下幾組,AngII組：10-6mol/L AngII分別刺激HPMEC 0、0.5、1、2、4 h;氯沙坦組：10-6mol/L氯沙坦(AngII1型受體阻滯劑)預(yù)先處理HPMEC 1h,再予相同濃度的AngII刺激細(xì)胞2h,

2、提取胞漿蛋白和胞核蛋白。凝膠電泳遷移率分析實(shí)驗(yàn)(EMSA)觀察細(xì)胞中NF-кB的DNA結(jié)合活性。Western印跡檢測(cè)細(xì)胞漿中抑制因子кB(IкBa)的含量。 結(jié)果:AngII刺激HPMEC 0.5h后細(xì)胞中NF-кB活性即明顯上升(144.5±16.1),在2h達(dá)到峰值(270.1±27.2),4h(215.1±17.8)較2h有所下降,但仍高于0h水平,以上各時(shí)間點(diǎn)與AngII刺激細(xì)胞0h(100±25.1)相比均有顯著性差

3、異(P<0.05)。與AngII刺激HPMEC 0h IкBa含量(44.4％±2.1％)相比,0.5h后IкBa含量即開(kāi)始下降(38.9％±3.6％,P<0.05),2h后IкBa含量下降最為明顯(32.6％±2.3％,P<0.05),4h細(xì)胞中IкBa含量較2h有所上升,但仍然明顯低于AngII刺激0h細(xì)胞中IкBa的含量(40.1％±4.7％,P<0.05)。氯沙坦組NF-кB活性及IкBa含量與0h相比無(wú)明顯差異(115.4±1

4、0.7,P>0.05)。氯沙坦組NF-кB活性明顯低于AngII刺激2h,該組中IкBa的含量明顯高于2h(43.6％±3.7％,P>0.05)。 結(jié)論:AngII能通過(guò)AT1介導(dǎo)HPMEC中NF-кB活化。經(jīng)典途徑參與了AngII誘導(dǎo)的HPMEC中NF-кB活化過(guò)程。 第二部分 目的:探討絲裂源活化蛋白激酶(MEK)在血管緊張素II(AngII)介導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HPMEC)中核因子-кB(NF-кB)活

5、化中的作用,進(jìn)一步研究AngII對(duì)NF-кB的活化機(jī)制。 方法:本實(shí)驗(yàn)分為以下幾組,AngII組：10-6mol/L AngII分別刺激HPMEC0、0.5、1、2、4 h;氯沙坦組：10-6mol/L氯沙坦(AngII1型受體阻滯劑)預(yù)處理HPMEC1h后,再予10-6mol/L AngII刺激細(xì)胞2h;U0126組：25μmol/L U0126(MEK阻滯劑)預(yù)處理HPMEC 1h后,再予10-6mol/L AngII刺激細(xì)

6、胞2h,提取胞漿蛋白和胞核蛋白。凝膠電泳遷移率分析實(shí)驗(yàn)(EMSA)觀察各組NF-кB活性。Western印跡檢測(cè)各組抑制因子кB(IкBa)及磷酸化的P65(P-P65)含量。 結(jié)果:與AngII刺激0h NF-кB活性(100±9.21相比,0.5h后NF-кB活性即開(kāi)始上升,且在2h達(dá)到峰值(276.1±20.4,P<0.05),氯沙坦組中NF-кB活性與0h相比無(wú)顯著性差異(110.4±8.7,P>0.05),但明顯低于A

7、ngII刺激2h NF-кB活性。U0126組NF-кB活性較AngII刺激2h明顯下降(195.4±13.2,P<0.05),但仍然高于0h水平。 AngII刺激HPMEC 0h細(xì)胞中IкBa含量為44.4％±2.2％,0.5h后IкBa含量即開(kāi)始下降,2h下降最為明顯(36.6％±2.3％),氯沙坦組IкBa含量(43.6％±1.4％)與0h相比無(wú)顯著性差異,U0126組IкBa含量(38.5％±2.1％)與2h相比無(wú)顯著性差異。A

8、ngII刺激細(xì)胞0.5h后P-P65含量即開(kāi)始上升(12.9±0.3),與0h含量(9.4±0.7)相比有顯著性差異,2h達(dá)到最高值(21.5±1.1),4h后有所下降(18.5±0.7)。氯沙坦組及U0126組中P-P65含量(10.3±0.9,10.4±0.5)與AngII刺激2h有顯著性差異,氯沙坦組P-P65含量與U0126組相比無(wú)顯著性差異。 結(jié)論:MEK依賴的P65磷酸化參與了AngII介導(dǎo)的HPMEC中NF-кB活