AT1-PI3K-NFκB途徑在AngⅡ介導(dǎo)的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用.pdf

1、第一部分，目的：探討血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)對(duì)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HPMEC)核因子-κB(NF-κB)的活化作用。 方法：采用原代培養(yǎng)的HPMEC，以濃度為10<'-8>、10<'-7>、10<'-6>、10<'-5>mol/L的Ang Ⅱ刺激細(xì)胞0、0.5、1、2、4小時(shí)，提取核蛋白，用凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)觀察各時(shí)間點(diǎn)NF-κB對(duì)DNA的結(jié)合活力。 結(jié)果：Ang Ⅱ能活化HPMEC中的NF-κB。Ang

2、Ⅱ 10<'-8>mol/L組在4h表現(xiàn)出明顯的NF-κB活化作用(與0h比較，p<0.05)；AngⅡ 10<'-7>mol/L組在1h開始活化NF-κB(與0h比較，p<0.05)，隨后NF-κB活化效應(yīng)逐漸增強(qiáng)；Ang Ⅱ 10<'-6>mol/L組NF-κB活性變化的時(shí)間依賴關(guān)系最為明顯，在1h開始活化NF-κB(與0h比較，p<0.05)，2h時(shí)達(dá)到高峰(與1h比較，p<0.05)，4h時(shí)活化水平已下降(與2h比較，p<0.0

3、5)；Ang Ⅱ 10<'-5>mol/L組在0.5h即明顯活化NF-κB(與0h比較，p<0.05)，隨后各時(shí)間點(diǎn)NF-κB活化效應(yīng)逐漸減弱。 結(jié)論：Ang Ⅱ刺激HPMEC后能引起NF-κB結(jié)合力增加，這可能是Ang Ⅱ促炎作用的重要環(huán)節(jié)。 第二部分，目的：探討Ang Ⅱ-AT1-P13K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)介導(dǎo)的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HPMEC)損傷作用中的作用。 方法：①以濃度為10<'

4、-6>mol/L的Ang Ⅱ刺激原代培養(yǎng)的HPMEC，western blot檢測(cè)0、2、5、10、20min時(shí)Akt的磷酸化水平，DAPI染色熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)0、6、12、18、24h時(shí)凋亡細(xì)胞百分比；②分別以10<'-6>mol/LLosartan(AT1阻斷劑)和10<'-4>mol/L Ly294002(P13K抑制劑)預(yù)處理HPMEC 1h后，再以相同濃度Ang Ⅱ刺激，檢測(cè)Akt磷酸化水平、NF-κB對(duì)DNA的結(jié)合力和

5、凋亡細(xì)胞百分比。 結(jié)果：Ang κ 10<'-6> mol/L刺激HPMEC后2min，Akt即明顯磷酸化(與0min比較，p<0.05)，此后磷酸化水平逐漸下降，但直至20min該效應(yīng)仍明顯高于0min組(與0min比較，p<0.05)，Ang Ⅱ刺激后12h細(xì)胞凋亡百分比開始增加(與0h比較，p<0.05)，24h時(shí)凋亡效應(yīng)最明顯(與18h比較，p<0.05)；Losartan阻斷AT1后，再以Ang Ⅱ刺激，2min時(shí)Ak

6、t磷酸化、2h時(shí)NF-κB活性增加和24h細(xì)胞凋亡效應(yīng)均受明顯抑制(與各對(duì)照組比較，p<0.05)：應(yīng)用Ly294002阻斷PI3K后，再以Ang Ⅱ刺激，Akt磷酸化水平降低至正常(與2min比較，p<0.05)，NF-κB活性也被部分抑制(與2h比較，p<0.05：與0h比較，p<0.05)，而24h細(xì)胞凋亡百分比保持不變。 結(jié)論：Ang Ⅱ刺激HPMEC后通過AT1引起Akt磷酸化、NF-κB活化和細(xì)胞凋亡等效應(yīng)；PI3K