Cdc42在急性肺損傷中對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞再生修復(fù)的影響及機(jī)制.pdf

1、急性肺損傷（Acute Lung Injury,ALI）和急性呼吸窘迫綜合癥(AcuteRespiratory Distress Syndrome，ARDS)是呼吸系統(tǒng)常見危重癥之一，對(duì)人類的健康和生產(chǎn)生活造成了嚴(yán)重的影響。目前，臨床上治療措施有限，死亡率居高不下。因此，探索ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制，尋求治療手段的新途徑，具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　ALI/ARDS的病理生理特征主要是肺內(nèi)的炎癥反應(yīng)以及毛細(xì)血管膜破損導(dǎo)致的肺水

2、腫，在此過程中，肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞最早受到傷害，是ALI/ARDS發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，促進(jìn)受損的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞再生，對(duì)修復(fù)微血管完整性，減輕肺組織炎性滲出，延緩肺損傷進(jìn)一步發(fā)展具有重要意義。而促進(jìn)血管再生修復(fù)的機(jī)制十分復(fù)雜，目前，研究者們?nèi)匀辉诓粩嗵剿髋c肺微血管內(nèi)皮再生能力相關(guān)的調(diào)控因素，籍此找到潛在的治療靶點(diǎn)。
　　細(xì)胞分裂周期蛋白42(cell division cycle42)，簡稱Cdc42，是Rho家族蛋白中的重要

3、成員，分子量大小為25KD。它具有很多非常重要的生物學(xué)活性，例如調(diào)控細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移，維持細(xì)胞極性等等。近年來，研究者們利用Cre/Loxp條件性基因敲除技術(shù)構(gòu)建動(dòng)物體內(nèi)特定器官或組織上敲除Cdc42基因的模型，來探索Cdc42的調(diào)控作用及機(jī)制。
　　研究目的：
　　在本課題中，利用該技術(shù)構(gòu)建了全身血管內(nèi)皮特異性敲除Cdc42基因的小鼠，首次探索了Cdc42在急性肺損傷中對(duì)肺微血管血管內(nèi)皮損傷與修復(fù)的影響及機(jī)制，

4、旨在發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)血管修復(fù)、改善ALI損傷程度的有效治療手段。
　　研究方法:
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):
　　1.1 pull-down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)急性肺損傷中肺組織的Cdc42活性水平。
　　1.2 利用cre/loxp技術(shù)構(gòu)建血管內(nèi)皮特異性敲除Cdc42基因小鼠模型，并在此基礎(chǔ)上再建立急性肺損傷，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)步驟。
　　1.3 所有小鼠收集左肺組織進(jìn)行固定、脫水、包埋，隨后進(jìn)行HE及病理評(píng)分，免疫組化染色觀察血管內(nèi)

5、皮增殖作用;右肺收集后提取蛋白，進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Cdc42蛋白表達(dá)水平。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)
　　2.1 培養(yǎng)原代肺微管內(nèi)皮細(xì)胞，利用cre/loxp技術(shù)構(gòu)建敲除Cdc42基因細(xì)胞模型。
　　2.2 選用人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞系，利用小RNA干擾技術(shù)敲低Cdc42表達(dá);在構(gòu)建好的細(xì)胞模型中，用BrdU檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，細(xì)胞跨膜電阻(TEER)和異硫氰酸熒光素-右旋糖苷透過率(FI

6、TC-Dextran)評(píng)價(jià)細(xì)胞屏障功能，用Matrigel實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞形成血管能力。
　　2.3 提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行western blot分析，檢測(cè)Cdc42下游相關(guān)信號(hào)通路的變化。
　　3.相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
　　研究結(jié)果:
　　1.ALI中肺組織Cdc42活性水平表達(dá)
　　LPS損傷處理后，肺組織中Cdc42GTP的表達(dá)水平有明顯改變。對(duì)比LPS未處理組（正常組），LPS1d組Cdc42GTP表達(dá)有所

7、下降，LPS處理后7天組的Cdc42GTP表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.穩(wěn)定構(gòu)建了血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性敲除Cdc42基因的動(dòng)物和原代細(xì)胞模型
　　構(gòu)建動(dòng)物模型后，敲除組的肺組織中Cdc42蛋白表達(dá)明顯小于未敲除組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。原代肺微血管細(xì)胞模型中，腺病毒敲除組的Cdc42蛋白表達(dá)同樣小于對(duì)照組。
　　3.穩(wěn)定構(gòu)建了敲低Cdc42水平的HPMVE細(xì)胞系。
　　HPM

8、VEC轉(zhuǎn)染siControl質(zhì)粒及siCdc42質(zhì)粒后，三個(gè)siCdc42都能抑制Cdc42蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.動(dòng)物水平上，在小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞上Cdc42基因敲除對(duì)ALI后炎性細(xì)胞浸潤、微血管滲漏以及肺微血管增殖能力的影響
　　Cdc42敲除組的ALI損傷評(píng)分、肺血管周圍中性粒細(xì)胞浸潤程度、肺微血管漏出率都明顯大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與對(duì)照組比較，敲除組血管增殖能力明顯

9、下降。
　　5.敲低HPMVEC中Cdc42水平對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、成管等的影響
　　與對(duì)照組相比，siCdc42組的血管內(nèi)皮增殖、遷移和血管成型能力明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(P＜0.05)。
　　6.敲低細(xì)胞中Cdc42表達(dá)水平可以下調(diào)PAK1/Akt信號(hào)通路的表達(dá)水平。
　　敲低Cdc42后，減少了PAK1、AKT的磷酸化及總量表達(dá)，并下調(diào)了VE-cadherin蛋白表達(dá)，對(duì)p-JNK/JNK、p-P38/

10、P38等的表達(dá)無影響。
　　研究結(jié)論:
　　1.Cdc42與肺炎性損傷的關(guān)系:Cdc42的缺失加重了ALI中的炎性細(xì)胞浸潤、肺微血管滲漏，破壞肺微血管屏障功能。因而Cdc42有可能成為改善ALI/ARDS的治療靶點(diǎn)。
　　2.Cdc42與肺微血管再生修復(fù)作用的關(guān)系:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲除Cdc42基因降低了肺微血管增殖能力;體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，下調(diào)Cdc42表達(dá)水平降低了肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、成管等一系列血管再生修復(fù)的能力