Apelin對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:血管緊張素Ⅱ?qū)Ψ挝⒀軆?nèi)皮細(xì)胞Apelin-APJ mRNA表達(dá)的影響
　　 目的:研究血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞Apelin-APJ mRNA表達(dá)的影響。
　　 方法:培養(yǎng)新生鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PMVECs),利用RT-PCR檢測(cè)PMVECsApelin-APJmRNA表達(dá)。取2-4代細(xì)胞,以5×105個(gè)/孔密度接種至6孔板,培養(yǎng)至80％融合后,進(jìn)行藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn):①加AngⅡ入6孔板中,至終

2、濃度分別為0、10-9、10-8、10-7、10-6(mol/L),每組設(shè)立4個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)24h終止實(shí)驗(yàn),檢測(cè)不同濃度AngⅡ?qū)MVECsApelin-APJ mRNA表達(dá)的影響;②加AngⅡ入6孔板至終濃度為10-7M,分別在0h、1h、6h、12h、24h、48h時(shí)間點(diǎn)終止實(shí)驗(yàn)。同時(shí)在0h、24h、48h點(diǎn)設(shè)立空白對(duì)照,加入等體積PBS。每組4個(gè)復(fù)孔。檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)10-7MAngⅡ?qū)MVECsApelin-APJ mRNA

3、表達(dá)。
　　 結(jié)果:①PMVECs存在Apelin-APJ mRNA表達(dá)。②與對(duì)照組(OMAngⅡ)比較,10-9MAngⅡ作用24h后ApelinmRNA表達(dá)上調(diào)(P＜0.01),隨著AngⅡ濃度上升,Apelin mRNA表達(dá)呈濃度依賴性持續(xù)下調(diào)(P＜0.05或P＜0.01);不同濃度AngⅡ(10-9-10-6M)呈濃度依賴性導(dǎo)致APJmRNA表達(dá)下降(P＜0.05或P＜0.01)。③10-7MAngⅡ作用于PMVECs后

4、,Apelin mRNA表達(dá)在6h內(nèi)增加(P＜0.05),其中在1h達(dá)到高峰(P＜0.01),6h后Apelin mRNA表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)明顯降低(P＜0.01);APJmRNA表達(dá)在0h-12h內(nèi)有增加趨勢(shì),12h后APJ mRNA表達(dá)隨10-7MAngⅡ作用時(shí)間延長(zhǎng)明顯下調(diào)(P＜0.01):0h、24h、48h時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照Apelin-APJ mRNA表達(dá)無明顯改變(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:AngⅡ?qū)MVECsApe

5、lin-APJ基因表達(dá)水平有明顯影響,Apelin-APJ系統(tǒng)可能參與AngⅡ?qū)?nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制。
　　 第二部分:Apelin對(duì)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　 目的:探討Apelin對(duì)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與凋亡的影響。
　　 方法:培養(yǎng)新生大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PMvECs),取2-4代PMVECs用于實(shí)驗(yàn):①以2000個(gè)/孔的密度接種至96孔板,分為3組:對(duì)照組加入等容量PBS;低濃度組(10-6MApe

6、lin組)加入10-8MApelin;高濃度組(10-6MApelin組)加入10-6MApelin。每組6個(gè)復(fù)孔。48h后用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT法)檢測(cè)各組OD值,計(jì)算細(xì)胞增殖率。②以5×105傳代至25ml的培養(yǎng)瓶,分為5組:對(duì)照組加入等容量PBS;低濃度組(10-8MApelin組)加入10-8MMapelin;高濃度組(10-6MApelin組)加入10-16MApelin;AngⅡ組加入10-7MAngⅡ;AngⅡ+A

7、pelin組加入10-8MApelin,10min后加入10-7MAngⅡ。每組5個(gè)復(fù)孔。24h后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　 結(jié)果:①與對(duì)照組比較,低濃度Apelin和高濃度Apelin都可導(dǎo)致PMVECsOD值增加,增殖率增加2.5倍以上(P＜0.01)。低濃度組和高濃度組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。②與對(duì)照組比較,低濃度Apelin組和高濃度Apelin組的PMVECs凋亡率降低50％以上(P＜0.05),AngⅡ組PMVE

8、Cs凋亡率明顯升高(P＜0.01);與AngⅡ組比較,AngⅡ+Apelin組PMVECs凋亡率明顯降低(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:Apelin促進(jìn)體外培養(yǎng)大鼠PMVECs增殖,抑制PMvECs凋亡。
　　 第三部分:Apelin對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用及其釋放№的機(jī)制研究
　　 目的:探討Apelin對(duì)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放ET-1的影響和刺激一氧化氮(NO)的釋放機(jī)制。
　

9、　 方法:培養(yǎng)新生鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PMVECs),取2-4代PMVECs用于實(shí)驗(yàn)。
　　 ①Apelin在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)PMVECs釋放NO的影響:以1×105個(gè)/孔密度接種至24孔板,80％融合后,無血清培養(yǎng)24h,分為2組:Apelin組,加入Apelin至終濃度為10-8M;對(duì)照組,加入等量無血清DMEM培養(yǎng)液。每組設(shè)立4個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng),并分別在0min、2min、5min、15min、30min五個(gè)時(shí)間點(diǎn)取培養(yǎng)液測(cè)

10、NO濃度。
　　 ②Apelin對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)PMVECs釋放ET-1的影響:分為4組:AngⅡ組,加入AngⅡ至終濃度為10-7M;AngⅡ+10-8MApelin組,加入10-7MAngll前5min加入10-8MApelin預(yù)處理;AngⅡ+10-6MApelin組,加入10-7MAngⅡ前5min加入10-6MApelin預(yù)處理;對(duì)照組,加入等量無血清DMEM培液。每組設(shè)立4個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng),并分別在0min、30min

11、、6h、24h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)取培養(yǎng)液檢測(cè)ET-1濃度。
　　 ③Apelin對(duì)PMVECsAkt/eNOS磷酸化影響:以5×105個(gè)/孔密度接種至6孔板,80％融合后,無血清培養(yǎng)24h,分為3組:Apelin組,加入Apelin至終濃度為10-8M;Apelin+Aktinhibitor組,加入Apein前用5ug濃度的Akt抑制劑預(yù)處理30min;對(duì)照組,加入等量DMEM培液。每組設(shè)立3復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)5min后立即提取總蛋白,用于

12、Western Bolt檢測(cè)磷酸化Akt和磷酸化eNOS表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 ①Apelin在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)PMVECs釋放NO的影響:
　　 在PMVECs培養(yǎng)液中加入10-8M的Apelin后,與對(duì)照組比較,培養(yǎng)液中NO濃度在2min、5min、15min時(shí)間點(diǎn)都出現(xiàn)增加(P＜0.01或P＜0.05);其中在5min時(shí)間點(diǎn)達(dá)到高峰(與對(duì)照組比較,P＜0.01);在30min時(shí)間點(diǎn),NO濃度與對(duì)照組比較無統(tǒng)

13、計(jì)學(xué)差異。
　　 ②Apelin對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)PMVECs釋放ET-1的影響:
　　 與對(duì)照組比較,AngⅡ組培養(yǎng)液中30min、6h、24h時(shí)間點(diǎn)的ET-1濃度都明顯升高(P＜0.05)。與AngⅡ組比較,AngⅡ+10-8MApelin組培養(yǎng)液中30min、6h、24h時(shí)間點(diǎn)的ET-1濃度都明顯降低(P＜0.05),接近對(duì)照組。與AngⅡ組比較,AngⅡ+10-6Apelin組的ET-1濃度有降低趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

14、。
　　 ③Apelin對(duì)PMVECsAkt/eNOS磷酸化影響:
　　 與對(duì)照組比較,Apelin組PMVECsAkt和eNOS磷酸化表達(dá)明顯增加(P＜0.01)。與Apelin組比較,Apelin+Aktinhibitor組PMVECseNOS磷酸化表達(dá)明顯降低(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:Apelin能促進(jìn)PMVECs釋放NO,抑制AngⅡ誘導(dǎo)的ET-1釋放。Akt/eNOS磷酸化增加是Apelin促進(jìn)N