D-serine在匹羅卡品致癇小鼠腦GABA能神經(jīng)元變性中的作用研究.pdf

1、癲癇是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其特點(diǎn)是自發(fā)的反復(fù)發(fā)作以及腦內(nèi)神經(jīng)元丟失。但其發(fā)病的神經(jīng)化學(xué)基礎(chǔ)或機(jī)制仍不清楚。以往的研究提示，顳葉癲癇的特點(diǎn)是病人腦內(nèi)神經(jīng)元丟失，反復(fù)發(fā)作，常常有認(rèn)知功能障礙以及大多數(shù)顳葉癲癇病人對(duì)現(xiàn)有的抗癲癇藥物或其他抗癲癇治療方法不敏感。越來越多的研究表明，NMDA受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對(duì)于神經(jīng)元的存活、突觸的可塑性以及興奮性突觸傳遞中具有重要作用，同時(shí)NMDA受體可能參與了癲癇的發(fā)生和發(fā)展，一些NMDA受體拮抗劑也顯

2、示具有抗癲癇效應(yīng)。然而，由于NMDA受體拮抗劑直接的和廣泛的功能性阻斷NMDA受體所導(dǎo)致的嚴(yán)重的不良反應(yīng)限制了NMDA受體拮抗劑在臨床的應(yīng)用。因此闡明NMDA受體相關(guān)的神經(jīng)化學(xué)遞質(zhì)的機(jī)制對(duì)于臨床慢性癲癇的藥物治療方案的選擇非常必要。
　　D-serine分子是一種D-氨基酸即右旋一絲氨酸，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元NMDA信號(hào)傳遞的調(diào)節(jié)中具有重要作用。D-serine與NMDA受體的甘氨酸位點(diǎn)相結(jié)合，在NMDA受體激活中充當(dāng)NMDA受體

3、的內(nèi)源性配體的角色。而且內(nèi)源性D-serine的釋放在興奮性毒性導(dǎo)致的大腦皮質(zhì)和海馬的神經(jīng)元傷中具有重要作用，因此D-serine參與了一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生。精神分裂癥的病人大腦中絲氨酸消旋酶表達(dá)的變化也表明D-serine信號(hào)與其疾病的發(fā)展有關(guān)。我們猜想D-serine信號(hào)途徑可能通過NMDA受體的過度活化、興奮性毒性和神經(jīng)元損傷參與慢性癲癇的發(fā)病和慢性癲癇的反復(fù)癲癇發(fā)作。在我們的前期研究中，已經(jīng)明確了小鼠匹羅卡品模型中大量的神經(jīng)元

4、死亡的時(shí)程變化特點(diǎn)；而且已證實(shí)連續(xù)腹腔注射擬膽堿劑匹羅卡品可以誘導(dǎo)癲癇發(fā)作、神經(jīng)元丟失和自發(fā)的反復(fù)癲癇發(fā)作，上述特點(diǎn)與人類的顳葉癲癇十分相似。因此，本課題采用小鼠匹羅卡品模型，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腦內(nèi)D-serine的細(xì)胞內(nèi)定位和D-serine陽性細(xì)胞的時(shí)空變化特點(diǎn)，D-serine與特異性標(biāo)記變性神經(jīng)元的Fluoro-JadeC染色、神經(jīng)元的標(biāo)記物NeuN、GABA能神經(jīng)元的標(biāo)記物GAD-67和星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物GFAP進(jìn)行雙標(biāo)記

5、等方法，以闡明D-serine信號(hào)可能參與慢性癲癇的神經(jīng)元死亡和慢性癲癇發(fā)病。
　　主要結(jié)果如下：
　　1．癲癇發(fā)作12-24h后在大腦皮質(zhì)、海馬、杏仁核和丘腦觀察到大量D-serine陽性細(xì)胞。它們分布于細(xì)胞的胞漿、胞膜上，陽性細(xì)胞呈橢圓形，平均直徑為24±6um。癲癇發(fā)作后3天的海馬切片觀察顯示，96％的D-serine陽性細(xì)胞為NeuN陽性。
　　2．免疫熒光雙標(biāo)記和激光共聚焦顯微鏡顯示，對(duì)照組沒有D-serin

6、e陽性神經(jīng)元。但是，在對(duì)照組和匹羅卡品模型組同時(shí)檢測(cè)到了星形膠質(zhì)細(xì)胞陽性的D-serine陽性細(xì)胞。D-serine陽性細(xì)胞在星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞體和突起都有分布。這些D-serine陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞在大腦皮質(zhì)和海馬上廣泛分布，它們的數(shù)目和密度在匹羅卡品模型中顯著提高。
　　3．D-serine陽性神經(jīng)元分布在大腦的運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)、軀體感覺皮質(zhì)、額眶部皮質(zhì)、梨狀皮質(zhì)、扣帶回皮質(zhì)、島葉皮質(zhì)、內(nèi)嗅皮質(zhì)和海馬的CA1、CA2、CA3和齒狀回。

7、此外，丘腦背側(cè)也可以觀察到陽性神經(jīng)元，外側(cè)丘腦下部也能觀察到少許陽性神經(jīng)元，但是腦干幾乎沒有檢測(cè)到陽性產(chǎn)物。而且D-serine陽性神經(jīng)元的數(shù)目在癲癇發(fā)作th到14d的范圍內(nèi)是隨時(shí)間變化的。th時(shí)沒有檢測(cè)到陽性神經(jīng)元，4h時(shí)D-serine陽性神經(jīng)元開始在腦的一些區(qū)域出現(xiàn)，大多數(shù)區(qū)域在12-24h時(shí)逐漸升高并達(dá)到高峰，3-14d時(shí)逐漸下降。
　　4．D-serine/GAD-67的雙標(biāo)記神經(jīng)元主要分布在大腦皮質(zhì)的錐體層和海馬的多形

8、細(xì)胞層，98％的D-serine陽性細(xì)胞為GAD-67陽性，D-serine/GAD-67的雙標(biāo)記神經(jīng)元占了GAD-67陽性細(xì)胞總數(shù)的34％，說明小鼠匹羅卡品模型中大多數(shù)D-serine陽性細(xì)胞為GABA能神經(jīng)元。
　　5．D-serine/FJC雙標(biāo)記神經(jīng)元多數(shù)分布在大腦皮質(zhì)的錐體層和海馬的多形細(xì)胞層。93％D-serine陽性神經(jīng)元為FJC陽性，說明小鼠匹羅卡品模型中D-serine陽性神經(jīng)元大多數(shù)發(fā)生了變性死亡。
　　

9、6．pNMDARl的免疫組織化學(xué)染色用來檢測(cè)NMDA受體的磷酸化，它可以反映神經(jīng)元中NMDA受體的活化狀態(tài)。小鼠匹羅卡品模型的大腦皮質(zhì)和海馬切片中觀察到了大量的pNMDARl陽性神經(jīng)元。pNMDARl分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿上。pNMDARl陽性神經(jīng)元與D-serine陽性神經(jīng)元在分布和數(shù)目的動(dòng)態(tài)變化上顯示出了一定的相似性。
　　以上研究結(jié)果提示，癲癇發(fā)作后腦內(nèi)D-serine的表達(dá)增多，D-serine的上調(diào)可能通過NMDA受體介導(dǎo)