siRNA沉默livin基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生長(zhǎng)及其凋亡的影響.pdf

1、背景和目的: 胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已處中晚期，失去了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)，只能進(jìn)行保守治療，而保守治療的效果往往不能令人滿意，其原因是多方面的，但腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制異常引起的凋亡抵抗被認(rèn)為是對(duì)化療、放療藥物不敏感的重要因素，因此從凋亡異常的發(fā)生機(jī)制著手，尋找逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞凋亡抵抗的靶點(diǎn)將會(huì)成為胃癌治療的新的研究方向。有研究表明，凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IA

2、P）家族是獨(dú)立于Bcl-2的細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白家族，包括多種蛋白，其中l(wèi)ivin是一種新發(fā)現(xiàn)的凋亡蛋白抑制基因成員，它們?cè)诘蛲龅恼{(diào)節(jié)中扮演著重要的角色。研究表明，腫瘤細(xì)胞中的IAP表達(dá)往往上調(diào)，通過(guò)阻斷或拮抗IAP的功能重新恢復(fù)惡性腫瘤（包括胃癌）對(duì)凋亡刺激劑（包括化療藥物）的敏感性，因此如果能夠抑制livin基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，將會(huì)恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性，大大提高腫瘤的治療效果。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于Livin的研究較少，且有資料顯示L

3、ivin與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。胃癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，Livin基因在胃癌的中所扮演的角色國(guó)內(nèi)外研究亦不多，值得我們深入研究。 RNAi（RNA interference）技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的基因沉默技術(shù)，能夠利用雙鏈RNA（dSRNA）特異性地降解與其同源的mRNA序列，阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。并且能夠在哺乳動(dòng)物中滅活或降低特異性基因的表達(dá)，產(chǎn)生類(lèi)似基因敲除的效應(yīng)。因此探討小干擾RNA（siRNA）對(duì)胃癌細(xì)胞livin基因表達(dá)

4、的基因沉默（gene silencing）作用，有望為胃癌的治療提供一種新的思路和方法。為此，本研究通過(guò)自行設(shè)計(jì)了靶向沉默Livin的siRNA真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞株BCG-823中來(lái)抑制Livin的表達(dá)，然后檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后胃癌BCG-828細(xì)胞的增值能力及凋亡敏感性的變化，觀察siRNA對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞株livin基因的表達(dá)影響，以探討siRNA在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡中的作用，為探索siRNA沉默livin基因抑制胃癌的發(fā)

5、病機(jī)制和臨床治療提供新的思路和理論依據(jù)。 方法: 1.利用Takara、Ambion和PromegasiRNA靶序列分析設(shè)計(jì)系統(tǒng)，掃描人livin（livinα和livinβ）cDNA編碼序列，依據(jù)siRNA靶序列設(shè)計(jì)原則，經(jīng)BLAST同源性分析選擇確定19個(gè)堿基的siRNA靶序列，同時(shí)隨機(jī)組合出一條對(duì)照序列。設(shè)計(jì)并化學(xué)合成2段編碼短發(fā)夾RNA序列的、靶向livin基因的寡核苷酸，再退火，克隆到經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切后的

6、siRNA表達(dá)載體啟動(dòng)子的下游，重組構(gòu)建RNAi質(zhì)粒同時(shí)設(shè)立非特異性對(duì)照，干擾載體用限制性核酸內(nèi)切酶酶切和測(cè)序鑒定。 2.脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株BGC-823后用G418篩選建立穩(wěn)定細(xì)胞系；觀察細(xì)胞形態(tài)，采用半定量RT-PCR檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞BGC-823 mRNA水平，比較不同組別的mRNA水平。 3.用四氮唑鹽比色法（MTT）檢測(cè)細(xì)胞增殖凋亡；熒光顯微鏡觀察siRNA轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算其轉(zhuǎn)

7、染綠。 結(jié)果: 1.通過(guò)同源序列檢索和進(jìn)一步優(yōu)選，確定了19個(gè)堿基為siRNA靶序列：GCGTCTGGCCTCCTTCTAT（440～458）和GTCTGGCCTCCTTCTATGA（442～460）。 2.siRNA發(fā)卡DNA的退火后，電泳可見(jiàn)明亮條帶，均位于約100bp處，與設(shè)計(jì)完全一致。 3.對(duì)胃癌細(xì)胞株BGC-823真核表達(dá)載體的構(gòu)建進(jìn)行酶切和序列分析，發(fā)現(xiàn)酶切圖譜及插入序列與預(yù)期結(jié)果一致。

8、 4.轉(zhuǎn)染siRNA組Livinα/βmRNA（0.11±0.07，0.13±0.04）表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組（0.37±0.10，0.43±0.09和空siRNA載體組（0.34±0.08，0.45±0.11， P<0.05）。 5.空白對(duì)照組與空siRNA載體組相比，24h、48h、96h和1周時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)未受影響；siRNA組在轉(zhuǎn)染后24h和48h細(xì)胞生長(zhǎng)也未受影響，但在96h和1周時(shí)則被明顯抑制（P<0.01）。

9、 6.轉(zhuǎn)染siRNA組的細(xì)胞的凋亡率（14.85±1.35）明顯高于空白對(duì)照組（4.51±0.36）和轉(zhuǎn)染空siRNA載體組（5.13±0.71），兩組差異有顯著性（P<0.05）。 結(jié)論: 1.成功構(gòu)建出針對(duì)livin的siRNA表達(dá)載體。 2.靶向siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞后能顯著降低livin基因的表達(dá)。 3.Livin基因與腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)，siRNA沉默livin基因能抑制胃癌細(xì)