泛素-蛋白酶體途徑在TRAIL誘導(dǎo)惡性淋巴瘤凋亡抵抗中的作用.pdf

1、目的:惡性淋巴瘤發(fā)病率居我國惡性腫瘤第八位,平均死亡年齡49.9歲,是嚴重危及兒童和青少年的惡性腫瘤。目前化療是治療惡性淋巴瘤的主要手段之一,因此如何篩選出有效的化療藥物,并且提高敏感性、克服耐藥性是當前急需解決的問題。
　　 TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)是近年發(fā)現(xiàn)的具有選擇性誘導(dǎo)腫瘤細胞,轉(zhuǎn)化細胞和病毒感染細胞凋亡而對正常細胞沒有毒性的腫瘤壞死因子家族成員。在Ⅰ型細胞

2、,活化的procaspase-8和procaspase-10通常直接觸發(fā)caspase依賴的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而導(dǎo)致細胞凋亡。但在Ⅱ型細胞,需要通過線粒體依賴的信號傳導(dǎo)途徑而導(dǎo)致細胞凋亡。目前研究表明TRAIL可以誘導(dǎo)許多惡性腫瘤細胞凋亡,但幾乎不引起正常細胞凋亡,因此TRAIL被認為是一種有希望的惡性腫瘤治療藥物。然而相當一部分腫瘤細胞,特別是一些高度惡性腫瘤表現(xiàn)出對TRAIL的原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥。闡述這類腫瘤細胞的耐藥機制對于有效的使

3、用TRAIL具有重要意義。在細胞凋亡通路中任何關(guān)鍵節(jié)點的功能失調(diào)都會導(dǎo)致細胞耐藥的產(chǎn)生。
　　 眾所周知,細胞凋亡過程是復(fù)雜的生物調(diào)控過程,主要是通過死亡受體途徑和線粒體途徑來介導(dǎo),兩者之間相互交叉,又能相互擴大來自對方的死亡信號,其中線粒體含有的多種成分如SMAC,細胞色素c更是對凋亡起著重要的調(diào)節(jié)作用,因此我們認為通過擴大或放大線粒體信號通路,也許能夠有效逆轉(zhuǎn)細胞耐藥。線粒體的穩(wěn)定性與Bcl-2家族蛋白有著極大的關(guān)聯(lián),這個家

4、族包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩大類:前者包括Bax、Bak、Bid、Bad等,而后者包括Bcl-2、Bcl-XL等,兩類蛋白的比例直接影響線粒體的穩(wěn)定性,從而觸發(fā)或抑制凋亡過程。其中Bax是一種重要的促凋亡蛋白。
　　 蛋白的翻譯后修飾是決定蛋白表達水平的一個重要因素。所有機體組織細胞中都存在溶酶體途徑、calpain系統(tǒng)、泛素-蛋白酶體途徑和泛素非依賴性等多種蛋白降解途徑,其中泛素-蛋白酶體途徑作用范圍非常廣泛。泛素化的蛋白質(zhì)

5、可以通過泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway)降解?？傊?通過我們的前期工作發(fā)現(xiàn)細胞中促凋亡蛋白Bax表達水平下降是藥物治療腫瘤過程中的一個頻發(fā)事件,可能與腫瘤的藥物抵抗密切相關(guān)。
　　 本實驗的研究目的是通過泛素-蛋白酶體途徑對促凋亡蛋白Bax表達調(diào)控機制的研究,探討在泛素調(diào)節(jié)下Bax水平、構(gòu)象、位置的變化,擬從整體角度闡述泛素-蛋白酶體系統(tǒng)對細胞內(nèi)關(guān)鍵蛋白的調(diào)節(jié)作用,為治療提供新的靶點

6、。
　　 方法:
　　 一、研究TRAIL誘導(dǎo)惡性淋巴瘤細胞凋亡情況:
　　 1.細胞培養(yǎng)及處理:本研究選擇B型惡性淋巴瘤細胞Raji、U937和人B淋巴母細胞Hmy2.ciR為研究對象。細胞經(jīng)RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)傳代培養(yǎng),待細胞生長至對數(shù)生長期時,使用濃度為500ng/mlTRAIL處理細胞。
　　 2.細胞凋亡檢測:分別采用500ng/mlTRAIL處理各組細胞,于0、6、24h不同時點收集2m

7、l處理后的細胞,離心洗滌后經(jīng)碘化丙錠(PI)和AnnexinV-FITC染色,采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。
　　 3.細胞凋亡中caspase-8、9酶活性測定:500ng/mlTRAIL處理各組細胞后,于0、6、24h不同時點收集10ml處理后的細胞,離心處理后加入caspase-8、9熒光底物30℃水浴15min,加入1％的醋酸鈉終止反應(yīng)。用TD-700熒光光度計在400/505nm反應(yīng)所釋放的熒光。
　　 4.采用

8、MTT法繪制細胞生長曲線:收集細胞按照每孔1×104個細胞設(shè)3個復(fù)孔,500ng/mlTRAIL處理各組細胞后,分別于0、2、4、6、8、24h取出細胞進行MTT檢測,繪制細胞生長曲線。
　　 二、研究TRAIL誘導(dǎo)惡性淋巴瘤細胞凋亡過程中Bax表達情況：
　　 1.靜息狀態(tài)下細胞內(nèi)源性Bax蛋白的表達水平和穩(wěn)定性:靜息狀態(tài)下收集細胞提取蛋白,western-blot檢測Bax蛋白的表達情況。
　　 2.采用we

9、stern-blot檢測TRAIL處理后細胞Bax蛋白表達水平及活性狀態(tài)3.采用RT-PCR檢測TRAIL處理后細胞Bax基因表達水平4.采用細胞亞結(jié)構(gòu)分離技術(shù)和western-blot觀察TRAlL,處理后Bax在細胞內(nèi)定位情況。
　　 三、研究泛素-蛋白酶體途徑對細胞內(nèi)Bax蛋白表達變化的調(diào)節(jié)作用1.泛素-蛋白酶體途徑在TRAIL作用過程中對Bax的調(diào)節(jié)作用,采用免疫共沉淀和western-blot檢測TRAIL作用過程中B

10、ax和泛素結(jié)合情況2.在體外狀態(tài)下模擬泛素-蛋白酶體途徑對Bax蛋白的調(diào)節(jié)作用。
　　 四、蛋白酶體抑制劑對惡性淋巴瘤耐藥機制的調(diào)節(jié)作用1.蛋白酶體抑制劑和TRAIL協(xié)同誘導(dǎo)惡性淋巴瘤凋亡的情況2.蛋白酶體抑制劑對Bax蛋白表達水平的調(diào)節(jié)作用結(jié)果:500ng/ml的TRAIL體外處理惡性淋巴瘤細胞Raji、U937,發(fā)現(xiàn)24小時后此兩種細胞的凋亡率明顯低于正常對照細胞Hmy2.ciR,Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)TRAIL處

11、理淋巴瘤細胞24小時后Bax蛋白表達水平呈明顯的下降趨勢；而同時RT-PCR檢測三種細胞的BaxmRNA表達水平卻未見差異性改變；當TRAIL和泛素-蛋白酶體抑制劑PS-341合用后可明顯逆轉(zhuǎn)惡性淋巴瘤細胞Raji、U937對TRAIL的耐藥情況,細胞凋亡率增加,同時Bax蛋白的表達水平也呈逐漸增加的趨勢；采用細胞亞結(jié)構(gòu)分離技術(shù)發(fā)現(xiàn)TRAIL作用后淋巴瘤細胞Raji、U937的細胞漿、線粒體Bax蛋白表達逐漸減少,而細胞核的Bax蛋白未

12、發(fā)生明顯變化,TRAIL與蛋白酶體抑制劑PS-341合用后Raji、U937的細胞漿、線粒體Bax蛋白表達逐漸增加,細胞核Bax蛋白仍未發(fā)生明顯變化；TRAIL作用細胞后Raji、U937的Ubiquitin蛋白表達逐漸增加；免疫沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)當TRAIL處理細胞6小時后,發(fā)生泛素化的Bax蛋白水平明顯增加；加入外源性ubiquitin(2μg/ml)后,淋巴瘤組織的Bax蛋白量逐漸減少,而癌旁組織的Bax蛋白量卻未見明顯變化。