泛素-蛋白酶體途徑參與小鼠SPEN家族MINT蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的研究.pdf

1、泛素-蛋白酶體途徑被認(rèn)為是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中選擇性的降解短壽命蛋白的主要系統(tǒng)。受調(diào)節(jié)蛋白主要與細(xì)胞周期進(jìn)程、應(yīng)激反應(yīng)、抗原呈遞、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、凋亡、細(xì)胞器官的生物發(fā)生有關(guān)。泛素化是一系列酶級(jí)聯(lián)傳遞泛素的結(jié)果。具體過(guò)程為，泛素激活酶E1催化泛素與底物蛋白結(jié)合，即以ATP依賴的方式通過(guò)硫醇酯鍵將泛素的C-端硫醇基與自身的半胱氨酸結(jié)合，然后將活化的泛素傳遞給泛素結(jié)合酶E2；泛素連接酶E3將結(jié)合著泛素的泛素結(jié)合酶和底物蛋白連

2、接，從而促進(jìn)泛素的羧基末端的甘氨酸與底物蛋白內(nèi)部的賴氨酸ε的氨基之間形成異肽鍵，泛素與蛋白結(jié)合；部分底物蛋白尚需要多聚泛素化聚集因子E4參與多聚泛素鏈的形成。之后，泛素多聚鏈的蛋白分子被26S蛋白酶復(fù)合體識(shí)別和降解，泛素-C-末端水解酶或者異肽酶酶解釋放泛素分子。 UbcH8是人的泛素結(jié)合酶基因UBE2L6編碼的蛋白，屬于主要包含Ubc結(jié)構(gòu)域的第一類泛素結(jié)合酶家族(ClassIE2s)成員。第一類泛素結(jié)合酶家族分子不能將泛素分

3、子直接傳遞給底物蛋白，提示這類E2需要借助泛素連接酶E3進(jìn)行底物蛋白的識(shí)別。研究表明：UbcH8可以與RINGfinger或者BRmotif-containingdomain(inbetweenRINGfingers)以及HECT[6]等結(jié)構(gòu)域的蛋白發(fā)生相互4作用。該酶已被證明可以在E6/E6AP促進(jìn)p53的泛素化中起作用。另外UbcH8作為泛素連接酶還可以促進(jìn)一種泛素樣分子ISG15的傳遞。 核基質(zhì)蛋白MINT(Msx2-i

4、nteractingnucleartargetprotein)是1999年Newberry等在研究與同源盒轉(zhuǎn)錄抑制因子Msx2相互作用的蛋白時(shí)，發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與Msx2共同參與顱面骨與神經(jīng)的發(fā)育的新的腳手架蛋白。與此同時(shí)，日本京都大學(xué)的T.Honjo研究組在利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選可以與RBP-J相互作用的新蛋白時(shí)，也篩選到了MINT分子(未報(bào)道)。MINT的轉(zhuǎn)錄物廣泛分布于各個(gè)組織。近年來(lái)的對(duì)MINT功能上的研究主要集中于：神經(jīng)發(fā)育、軟骨和

5、成骨，淋巴系統(tǒng)發(fā)育上。 MINT屬于Spen蛋白家族。SPEN蛋白家族成員具有的共同特點(diǎn)是：含有多個(gè)RNA識(shí)別基序(RNArecognitionmotif，RRM)和一個(gè)保守的C-端的SPOC結(jié)構(gòu)域[。SPOC結(jié)構(gòu)域可以募集共抑制復(fù)合物SMRT/N-CoR從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用。MINT可在許多不同的信號(hào)途徑中調(diào)節(jié)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)分子表達(dá)。Kuroda等和Oswald等發(fā)現(xiàn)MINT與Notch信號(hào)途徑的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子RBP-J相互

6、作用，并可能通過(guò)與Notch受體胞漿區(qū)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RBP-J結(jié)合位點(diǎn)從而抑制Notch信號(hào)途徑。Towler等研究認(rèn)為：MINT具有增強(qiáng)Runx2募集于成纖維生長(zhǎng)因子反應(yīng)元件(OCFRE)的活性。最近我們研究組的研究表明：MINT也可以參與αA-晶狀體球蛋白結(jié)合蛋白1介導(dǎo)的Col2a1基因的轉(zhuǎn)錄抑制。 MINT在人類中的同源物SHARP是以HDAC共抑制復(fù)合物的新組份的形式發(fā)現(xiàn)的。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，HDAC的抑制劑TSA可以抑制M

7、INT/SHARP所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制作用，這些說(shuō)明MINT/SHARP的轉(zhuǎn)錄抑制作用是HDAC依賴性的。Towler等研究表明MINT可以作為作為核基質(zhì)的平臺(tái)組織和整合骨鈣素基因5的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；最近，F(xiàn)ranzOswald等研究SHARP/MINT的轉(zhuǎn)錄機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)：一個(gè)包括CtIP/CtBP的抑制復(fù)合體可以促進(jìn)RBP-J/SHARP-介導(dǎo)的Notch靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制。總之，MINT可以通過(guò)蛋白-蛋白相互作用，募集HDAC或者CtIP和CtB

8、P等方式調(diào)節(jié)許多包括Msx2，RBP-J，核受體，AlphaA-CRYBP1等轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄；另外在核基質(zhì)中，MINT可以作為腳手架蛋白的平臺(tái)組織和整合多個(gè)調(diào)控信號(hào)。MINT作為位于細(xì)胞核內(nèi)的大分子腳手架蛋白，廣泛分布于各個(gè)組織，其功能是復(fù)雜的，轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制也是多樣的。對(duì)這兩方面的研究還存在許多空白點(diǎn)。 為了進(jìn)一步深刻理解MINT的功能和介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制，我們首先使用了酵母雙雜交的方法，對(duì)MINT蛋白進(jìn)行了相關(guān)蛋白的篩

9、選。其中在對(duì)其C末端區(qū)域的篩選中，使用人的淋巴結(jié)的cDNA文庫(kù)我們篩選到了一個(gè)編碼人泛素結(jié)合酶UbcH8的UBE2L6基因。進(jìn)而使用不同的MINT的截短體，利用酵母雙雜交的方法再次對(duì)MINT與UbcH8相互作用的區(qū)域進(jìn)行了初步定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MINT的SPOC結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)它與UbcH8之間的相互作用，該區(qū)域已經(jīng)被認(rèn)為是介導(dǎo)MINT與其他分子相互作用的界面。之后，我們又使用了一系列的生物化學(xué)的方法(GSTpull-downassay、哺乳動(dòng)物

10、細(xì)胞內(nèi)雙雜交及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn))對(duì)MINT與UbcH8之間的體外和體內(nèi)相互作用進(jìn)行了深入驗(yàn)證，確證它們之間存在物理上的相互作用。最后；利用報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)MINT與UbcH8之間相互作用的生理意義。結(jié)果顯示：MINT抑制RBP-J介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄對(duì)于泛素-蛋白酶體途徑的抑制劑MG132是敏感的。低劑量的MINT可以抑制Notch受體胞內(nèi)段(Notchintracellulardomain，NICD)激活Notch信號(hào)途徑的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RBP-J

11、調(diào)控的報(bào)告基因的活性，并且UbcH8可以增強(qiáng)MINT發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制。因此我們初步得出結(jié)論：MINT介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可以至少部分依賴于UbcH86所在的泛素-蛋白酶體途徑(Ubiquitinproteasomesystem,UPS)的調(diào)節(jié)。 此外，在確定UPS調(diào)節(jié)MINT調(diào)控的底物蛋白時(shí)，我們使用不同于NICD的激活物：EBNA2和VP16激活的RBP-J調(diào)節(jié)的報(bào)告基因系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：加入U(xiǎn)bcH8后，并不能增強(qiáng)MINT抑制EBNA

12、2和VP16激活的RBP-J介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性，所以排除了RBP-J是UbcH8和MINT介導(dǎo)的泛素化底物。新的底物蛋白的篩選是先理論假設(shè)某底物蛋白可以被UPS泛素化后而被降解，并且該底物蛋白與MINT和UbcH8關(guān)聯(lián)。在MINT相關(guān)的Notch信號(hào)途徑中，NICD分子可以被泛素化，并可通過(guò)UPS降解[20]。那么MINT能否與NICD相互作用，并將泛素分子傳遞給NICD?我們首先使用酵母雙雜交來(lái)驗(yàn)證上述假設(shè)的理論。通過(guò)酵母雙雜交，我們初步

13、得出：MINT的-N末端可以與NICD相互作用，符合了理論假設(shè)的前提條件。然而MINT是否在與UbcH8的相互作用中扮演泛素連接酶的作用向底物傳遞泛素分子?或者兩者之間的相互作用可以介導(dǎo)MINT的泛素化修飾，或者M(jìn)INT是以E2/E3泛素化復(fù)合體的形式扮演腳手架的結(jié)構(gòu)平臺(tái)作用?其底物蛋白是什么?NICD?與MINT相關(guān)的已經(jīng)被證明可以被泛素化的Runx2?亦或是其他蛋白呢?這些問(wèn)題仍需要進(jìn)一步的深入研究。總之，本文提供的結(jié)果可能提示一種