泛素-蛋白酶體途徑在青扦花粉萌發(fā)及花粉管生長過程中的作用.pdf

1、本文利用統(tǒng)計學分析、超微結構觀察、免疫膠體金標記、免疫熒光標記、免疫印跡以及顯微紅外光譜分析等技術，比較系統(tǒng)地研究了蛋白酶體抑制劑MG132以及epoxomicin對裸子植物青扦(Piceawilsonii)花粉萌發(fā)、花粉管生長速率、花粉管形態(tài)、花粉管超微結構，細胞骨架以及細胞壁成分等方面的影響，旨在從細胞水平進一步探討泛素/蛋白酶體途徑在花粉管極性生長模式的建立和維持中的作用。 實驗結果表明：可逆性的蛋白酶體抑制劑MG132不

2、僅劑量依賴性的遲滯青扦花粉萌發(fā)，而且時間依賴性地抑制花粉管生長，并引起花粉管頂端膨大、直徑不規(guī)則變粗以及花粉管細胞質液泡化等現象；此外，不可逆的蛋白酶體抑制劑epoxomicin處理青扦花粉管也得到與MG132處理類似的結果，而非蛋白酶體抑制劑E-64處理并不對青扦花粉管產生類似作用；熒光分光光度計法分析花粉蛋白粗提物降解人工合成的蛋白酶體熒光底物sLLVY-AMC結果證實正常青扦花粉管中存在活躍的蛋白酶體活性，而MG132劑量依賴性地

3、抑制蛋白酶體活性；免疫印跡實驗結果進一步證實MG132處理導致花粉管中泛素綴合蛋白的大量積累；TEM分析結果表明，正常花粉管中細胞器呈極性分布，而MG132處理導致花粉管細胞器極性分布模式破壞，并引起花粉管中ER起源的細胞質液泡化；免疫金標實驗進一步表明MG132處理后導致花粉管細胞質和ER上積累了大量的泛素綴合蛋白，這一結果與以往認為的UPP參與動物細胞ER中錯誤翻譯(或折疊)蛋白的清除一致；利用FITC標記的鬼筆環(huán)肽，我們發(fā)現正?；?/p>

4、粉管中，微絲以與花粉管長軸平行的方向，從花粉管基部一直延伸到花粉管亞頂端，而抑制劑處理時間依賴性地導致花粉管中微絲骨架解聚；熒光標記結果還表明Mg132處理導致花粉管中微管排列紊亂，尤其在花粉管頂端和亞頂端區(qū)域；Fluo-3/AM標記結果表明正常生長的花粉管頂端存在一個顯著的鈣離子梯度，而MG132處理后花粉管頂端的鈣離子梯度雖然下降的更快，但梯度仍然存在；利用共聚焦顯微鏡得到的顯微縮時電影結果表明，抑制劑處理導致花粉管中胞質環(huán)流的速度

5、和方向發(fā)生顯著變化，這從另一個側面證實抑制劑處理引起細胞骨架，尤其是微絲骨架的破壞；此外，利用單克隆抗體JIM5和JIM7，我們發(fā)現正?；ǚ酃苤絮セz集中分布于花粉管頂端，而酸性果膠則從花粉管亞頂端朝花粉管基部逐漸增強，而抑制劑處理后導致花粉管細胞壁中果膠含量急劇下降，果膠的分布模式也發(fā)生顯著變化；利用熒光增白劑，我們發(fā)現抑制劑處理還導致花粉管中纖維素含量的急劇下降，尤其是花粉管頂端和亞頂端區(qū)域；為了進一步證實MG132處理引起的花粉

6、管細胞壁成分的變化，我們還利用FTIR技術進行了分析，結果再一次表明蛋白酶體抑制劑處理劑量依賴性地導致花粉管細胞壁的各種成分含量下降，尤其在花粉管的頂端和亞頂端區(qū)域。上述結果中，蛋白酶體抑制劑處理引起花粉管中細胞骨架，尤其是微絲骨架的解聚以及花粉管細胞壁構建紊亂在國內外尚屬首次報道；而抑制劑處理引起花粉管中ER起源的細胞質液泡化在植物細胞中也是一個新的發(fā)現。根據上述研究結果，結合前人報道，我們認為泛素/蛋白酶體途徑通過參與內質網中相關蛋

7、白的清除(ER-AssociatedproteinDegration；ERAD)以及細胞質中一些與細胞骨架構建緊密相關蛋白的調節(jié)，在青扦花粉管極性生長過程中起重要作用；抑制花粉管中蛋白酶體的正常功能引起花粉管中泛素化蛋白質的積累，導致ER起源的細胞質液泡化以及細胞骨架，尤其是微絲骨架構建紊亂，進而導致細胞壁機械強度下降?？紤]到植物細胞延伸取決于細胞內膨壓以及細胞壁對細胞內膨壓的耐受程度。抑制劑處理一方面引起花粉管中ER起源的細胞質液泡化