泛素—蛋白酶體系統(tǒng)在PRRSV增殖過程中的作用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，俗稱藍(lán)耳病，是一種病毒性傳染病，主要引起懷孕母豬發(fā)熱、繁殖障礙以及仔豬呼吸道異常癥狀和高死亡率。豬繁殖與呼吸綜合征的病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)。PRRSV為動脈炎病毒科的成員，病毒粒子呈球型，直徑為55～60nm，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒。目前，對PRRSV的復(fù)制以及分子致病機(jī)理方面研究還不

2、是很明晰。
　　 泛素是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的小分子蛋白質(zhì)，物種間保守性很強(qiáng)，由76個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為8KDa，在降解內(nèi)源性蛋白質(zhì)以及對多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)方面扮演著相當(dāng)重要的角色。在病毒感染的不同階段，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)也起著至關(guān)重要的作用，很多病毒都存在利用和調(diào)節(jié)宿主泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的現(xiàn)象，PRRSV是否也存在這種現(xiàn)象呢？本實(shí)驗(yàn)對此進(jìn)行了研究，以期揭示泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在PRRSV增殖中的作用。主要研究內(nèi)容如下：<

3、br>　　 1.PRRSV感染對細(xì)胞蛋白泛素化的影響
　　 以PRRSV感染Marc-145細(xì)胞，于感染后不同時(shí)間點(diǎn)收樣，Western Blotting檢測細(xì)胞內(nèi)自由泛素和多聚泛素化蛋白含量的相對變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRRSV感染細(xì)胞后的24-42h期間，胞內(nèi)多聚泛素化蛋白的含量急劇降低，自由泛素增多，此后，又恢復(fù)到病毒感染早期的水平。而未接毒的對照組多聚泛素化蛋白水平在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中變化不大。結(jié)果說明PRRSV感染會影響細(xì)胞內(nèi)

4、的泛素化水平。
　　 2.26S蛋白酶體功能的抑制不利于PRRSV增殖
　　 選用3種蛋白酶體抑制劑處理Marc-145細(xì)胞并接種PRRSV，于24h后收樣，用蝕斑法檢測病毒滴度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制劑MG132和Bortezomib對PRRSV的增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用，而抑制劑Lactacystin的作用不明顯。于是將MG132和Bortezomib以不同濃度處理細(xì)胞，在接種PRRSV后24h收樣，檢測病毒滴度。結(jié)果與對照相比

5、，兩種抑制劑都顯著降低病毒的增殖滴度，并且抑制劑濃度越高抑制效果越明顯，呈劑量依賴性。隨后以2μM的MG132和1μM的Bortezomib分別處理細(xì)胞，接毒后于不同時(shí)間點(diǎn)收樣，繪制病毒的增殖曲線，結(jié)果兩種抑制劑處理后病毒的增殖曲線與對照一致，但增殖滴度均明顯低于對照。這些結(jié)果充分說明，蛋白酶體抑制劑MG132和Bortezomib能顯著抑制PRRSV的增殖。
　　 3.26S蛋白酶體功能的抑制阻礙PRRSV蛋白的合成
　

6、　 分別用不同濃度的抑制劑MG132和Bortezomib處理Marc-145細(xì)胞，接種PRRSV后24h收樣，Western Blotting檢測PRRSV Nsp2蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著抑制劑使用劑量的增加，Nsp2的表達(dá)量不斷減少，且呈劑量依賴性。隨后以2μM的MG132和1μM的Bortezomib分別處理細(xì)胞，于接毒后不同時(shí)間點(diǎn)收樣，WesternBlotting檢測PRRSV的Nsp2蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，抑制劑推遲了P

7、RRSV非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2的表達(dá)，并且減少其表達(dá)量。
　　 4.蛋白酶體抑制劑主要在病毒增殖的中期起作用
　　 PRRSV接種Marc-145細(xì)胞后，于病毒增殖的不同階段分別用抑制劑MG132(2μM)和Bortezomib(1μM)處理接毒細(xì)胞。40h收樣后，檢測PRRSV的滴度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒增殖的中期(接毒后16-24h)用抑制劑處理Marc145細(xì)胞，病毒滴度下降最為明顯；在病毒增殖的其他階段(接毒后0-16h)

8、和晚期(接毒后24-40h)用抑制劑處理病毒滴度有所下降，且越接近中期病毒滴度下降越明顯?？梢?，在病毒增殖的中期，功能完整的蛋白酶體是病毒順利增殖的必要條件。
　　 5.超表達(dá)泛素基因有助于PRRSV增殖
　　 Marc-145細(xì)胞轉(zhuǎn)染泛素真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-(HA-Ub)4和空載體對照，轉(zhuǎn)染24h后接種PRRSV，超表達(dá)組和對照組分別用蛋白酶體抑制劑MG132(2μM)和Bortezomib(1μM)以及DMSO處理