高遷移率族蛋白B1(HMGB1)與血栓閉塞性脈管炎的相關性及HMGB1 A Box對其保護機制的研究.pdf

1、研究背景和研究目的:
　　 血栓閉塞性脈管炎(thromboangitis obilterans，TAO)是一種以中小動靜脈慢性節(jié)段性病變?yōu)橹鞯难仔蚤]塞性疾病，其主要侵襲四肢，尤其是下肢的中小動脈靜脈，引起患肢遠端缺血性病變。該病在各種族中均有發(fā)病，在歐洲它占到所有住院動脈閉塞性疾病的5％，而在日本則上升為16％?；颊叨酁榍鄩涯昴行裕^大多數(shù)有吸煙史。其病程呈進展性，常表現(xiàn)為間歇性跛行、靜息痛、潰瘍及血栓性淺靜脈炎等，患者生活質(zhì)

2、量受到嚴重影響，甚至面臨截肢。已有研究顯示血栓閉塞性脈管炎患者的動脈內(nèi)膜中粘附因子血管內(nèi)皮細胞粘附分子-1(VCAM-1)、細胞間粘附分子-1(ICAM-1)、E選擇素、腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達明顯增多，炎細胞浸潤并且內(nèi)膜明顯增厚，因此將其定義為炎性疾病。盡管對其病因、病程進展、治療等方面進行了大量研究，但關于血栓閉塞性脈管炎的機制仍然沒有完全闡明，目前尚無有效治療方法。
　　 高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是為一種重

3、要的炎癥介質(zhì)和致炎細胞因子。當細胞活化或死亡時，HMGB1可被壞死或受損細胞被動釋放至胞外，與其受體晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)和/或TOLL樣受體結合傳遞胞內(nèi)信號并介導細胞反應，包括趨化細胞運動、釋放促炎因子及粘附因子，它是啟動和維持炎癥瀑式反應的中心分子，HMGB1在多種炎癥病理中作為一種信號傳導和放大因素，可以增強炎癥反應強度，延長炎癥病理過程。目前發(fā)現(xiàn)在膿毒血癥、急性胰腺炎及一些無菌性炎癥包括關節(jié)炎、紅斑狼瘡、缺血再灌注損

4、傷的患者血清及組織中HMGB1水平明顯升高。同時已有研究表明HMGB1參與動脈粥樣硬化、心肌梗死等多種心血管疾病并介導內(nèi)皮細胞的損傷，HMGB1與內(nèi)皮細胞共孵育能以時間依賴的方式增加ICAM-1、VCAM-1及RAGE的表達，促使TNF-α、單核細胞趨化蛋白(MCP-1)、白細胞介素-6(IL-6)分泌，并可誘導內(nèi)皮細胞釋放纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)引起血小板變形。但HMGB1在血栓閉塞性脈管炎的作用目前未見報道。
　

5、　 HMGB1自身有A和B兩個DNA模體，結構功能分析顯示其活化細胞因子的結構域定位在B盒子上，而A盒子競爭HMGB1的結合位點，減弱HMGB1全長的生物效應?，F(xiàn)有研究表明HMGB1內(nèi)源性抑制劑重組HMGB1 Abox(rAbox)可以競爭性抑制HMGB1的促炎作用，在多種炎性動物模型中起到保護作用。
　　 鑒于血栓閉塞性脈管炎的炎性病變基礎及HMGB1在介導炎癥及內(nèi)皮損傷過程中的重要性，本論文中我們通過建立大鼠血栓閉塞性脈管

6、炎模型，研究了HMGB1與血栓閉塞性脈管炎的關系，探討HMGB1內(nèi)源性抑制劑重組HMGB1 Abox對于血栓閉塞性脈管炎大鼠的影響及相關分子機制，為明確血栓閉塞性脈管炎的發(fā)病機制和尋找有效治療措施提供理論依據(jù)。
　　 研究內(nèi)容:
　　 1.建立大鼠血栓閉塞性脈管炎模型;
　　 2.研究HMGB1及其受體RAGE是否參與血栓閉塞性脈管炎發(fā)展;
　　 3.抑制HMGB1，能否抑制血栓閉塞性脈管炎病情進展;

7、r>　　 4.分析HMGB1參與血栓閉塞性脈管炎發(fā)展及其內(nèi)源性抑制劑減緩血栓閉塞性脈管炎病情進展的相關機制。
　　 研究方法:
　　 1.動物處理:股動脈注射月桂酸建立大鼠血栓閉塞性脈管炎模型，對照組注射等劑量的生理鹽水，治療組采用腹腔注射不同劑量重組HMGB1 Abox觀察其療效。
　　 2.大鼠患肢體征變化的觀察:術后每日觀察患肢的大體表現(xiàn)，術后15天參照日本學者Murakami提出的分級標準評級。

8、　　 4.收集組織:處理結束后，收集大鼠股動脈、血液備用。
　　 5.組織形態(tài)學分析:蘇木精-伊紅染色，觀察管壁結構及血管通暢性，計算血管腔內(nèi)血栓面積。
　　 6.血液學檢測:收集大鼠血液行血細胞計數(shù)及凝血指標檢測。
　　 7.血漿中蛋白水平的分析:利用試劑盒檢測血漿中HMGB1、血栓素B2(TXB2)、6-酮-前列腺素F1α(6-K-PGF1α)蛋白水平。
　　 8.股動脈中蛋白水平的分析:
　

9、　 1)用免疫組織化學法結合激光掃描共聚焦顯微術，檢測HMGB1及其受體晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)在血管壁中蛋白表達水平及分布。
　　 2)用Westem blot方法，檢測蛋白的表達水平。
　　 9.股動脈中炎性因子及粘附因子蛋白水平的分析:
　　 1)用免疫組織化學法，檢測炎性因子白介素-6(IL-6)、粘附因子血管內(nèi)皮細胞粘附分子-1(VCAM-1)和細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的蛋白表達水

10、平及分布。
　　 2)用Western blot方法，檢測蛋白的表達水平。
　　 10.股動脈中基因水平的分析:利用實時熒光定量PCR術，檢測動脈中HMGB1、RAGE、IL-6、VCAM-1、ICAM-1的mRNA水平。
　　 研究結果:
　　 1.利用股動脈注射月桂酸法成功建立大鼠血栓閉塞性脈管炎模型
　　 1.1注射月桂酸15天后，模型組大鼠呈現(xiàn)血栓閉塞性脈管炎的典型癥狀和體征。
　　

11、 1.2 HE染色顯示:動脈壁炎細胞浸潤，腔內(nèi)血栓形成，管腔狹窄幾近閉塞。
　　 2.HMGB1及其受體RAGE參與了血栓閉塞性脈管炎的發(fā)展
　　 2.1我們檢測了各組動物血漿中HMGB1蛋白變化。模型組血漿中HMGB1的蛋白水平較正常組及假手術組明顯升高(p＜0.01)，正常組及假手術組之間沒有顯著差異。
　　 2.2對各組動物股動脈組織切片進行免疫組織化學染色和雙染免疫熒光染色發(fā)現(xiàn):模型組中HMGB1主要在

12、內(nèi)膜及中膜的胞質(zhì)中表達，其受體RAGE主要主要在內(nèi)膜中表達。模型組股動脈中HMGB1及其受體RAGE的蛋白水平較正常組及假手術組明顯升高。
　　 2.3對各組動物股動脈組織進行Western Blot和PCR分析發(fā)現(xiàn):模型組股動脈中HMGB1及其受體RAGE的蛋白及mRNA水平較正常組及假手術組明顯升高(p＜0.01)
　　 3.抑制HMGB1能夠抑制血栓閉塞性脈管炎病情進展
　　 3.1處理結束后對各組大鼠根據(jù)

13、Murakami分級標準評級結果顯示模型組病變等級較假手術組明顯升高，腹腔注射低劑量及高劑量重組HMGB1 A box均明顯降低血栓閉塞性脈管炎病變等級。
　　 3.2 HE染色顯示:低劑量重組HMGB1 A box減低，高劑量重組HMGB1 A box明顯降低血栓閉塞性脈管炎模型中股動脈血栓面積(p＜0.05)。
　　 3.3 ELISA結果顯示:低劑量重組HMGB1 A box抑制血漿中HMGB1表達。高劑量重組HM

14、GB1 A box顯著降低血漿中HMGB1表達(p＜0.05)。
　　 3.4處理各組動物股動脈組織進行免疫組織化學染色、雙染免疫熒光染色、Western Blot和PCR結果顯示:低劑量重組HMGB1 A box抑制血管壁中HMGB1、RAGE蛋白及mRNA表達水平。高劑量重組HMGB1 Abox顯著抑制血管壁中HMGB1、RAGE蛋白及mRNA表達水平。上述實驗結果證明重組HMGB1 A box通過抑制HMGB1及RAGE表

15、達減緩病情進展并呈劑量依賴性。
　　 4.HMGB1參與血栓閉塞性脈管炎病情發(fā)展及重組HMGB1 A box保護機制的研究
　　 4.1模型建立成功后，我們對各組動物股動脈組織切片進行免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn):模型組血管壁中炎性因子IL-6、粘附因子VCAM-1和ICAM-1的蛋白水平較正常組及假手術組明顯升高(p＜0.05)，正常組及假手術組之間無明顯差異。
　　 4.2股動脈組織進行Western Blot和PC

16、R分析發(fā)現(xiàn):模型組股動脈中炎性因子IL-6、粘附因子VCAM-1和ICAM-1的蛋白及mRNA水平較正常組及假手術組明顯升高(p＜0.05)。
　　 4.3應用低劑量及高劑量重組HMGB1 A box腹腔注射后，免疫組織化學染色， Western Blot及PCR檢測結果顯示高劑量重組HMGB1 A box顯著抑制血管壁中炎性因子IL-6、粘附因子VCAM-1和ICAM-1蛋白及mRNA表達水平(p＜0.05)。
　　

17、4.4在血液學檢查中我們發(fā)現(xiàn)模型組中血小板計數(shù)(PLT)及纖維蛋白原(FIB)較正常組及假手術組明顯升高(p＜0.05)。凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)較正常組及假手術組明顯降低(p＜0.05)。而紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)在各組中未見明顯變化。
　　 4.5應用重組HMGB1 Abox處理后，高劑量處理組血小板計數(shù)(PLT)及纖維蛋白原(FIB)較模型組明顯降低(p＜0.

18、05)。凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)較模型組明顯升高(p＜0.05)。低劑量重組HMGB1 Abox起到相同的作用，但效果較弱。
　　 4.6血栓素B2(TXB2)、6-酮-前列腺素F1α（6-K-PGF1α）分別是血栓素A2(TXA2)和前列環(huán)素(PGI2)的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物，兩者分別誘導和抑制血小板聚集。對各組動物血漿行ELISA檢測發(fā)現(xiàn):模型組血漿中6-K-PGF1α較正常組及假手

19、術組明顯降低(p＜0.05);而TXB2及TXB2/6-K-PGF1α明顯升高(p＜0.05)。在應用低劑量和高劑量重組HMGB1 Abox處理后血漿中6-K-PGF1α水平明顯升高(p＜0.05);TXB2及TXB2/6-K-PGF1α明顯降低(p＜0.05)。
　　 結論:
　　 1.HMGB1及其受體RAGE參與月桂酸誘導的大鼠血栓閉塞性脈管炎模型中。
　　 2.HMGB1抑制劑重組HMGB1 Abox能夠