肝細(xì)胞分泌高遷移率族蛋白HMGB1的過程觀察及其提純方法初步探討.pdf

1、研究背景：重型肝炎是一種病死率很高的臨床危重癥。在我國，重型肝炎的主要原因仍是病毒性肝炎。研究證明，高遷移率族蛋白-1(HMGB1)在重型肝炎的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。核蛋白HMGB1是生命所必須物質(zhì)，近年來，胞外HMGB1的促炎癥作用受到越來越多的學(xué)者關(guān)注。正常情況下，HMGB1動(dòng)態(tài)結(jié)合于細(xì)胞核染色質(zhì)上，因此，HMGB1如何從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外是其發(fā)揮胞外作用的關(guān)鍵。目前已經(jīng)取得共識(shí)的是“活化免疫細(xì)胞的主動(dòng)分泌”和“壞死細(xì)胞的被動(dòng)漏

2、出”兩種形式。而課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞作為實(shí)質(zhì)細(xì)胞，在非壞死情況下亦能釋放HMGB1，但其釋放過程尚不明確。本研究第一部分以業(yè)已明確的免疫細(xì)胞分泌HMGB1的過程特點(diǎn)為對(duì)照，探討肝細(xì)胞分泌HMGB1的條件，旨在回答上述問題。同時(shí)，肝細(xì)胞作為實(shí)質(zhì)細(xì)胞，卻證實(shí)同免疫細(xì)胞一樣，能分泌炎癥因子HMGB1，但其分泌的HMGB1有何生物學(xué)特性尚不明確。而探討其生物學(xué)特性的前提是分離提純出其分泌的HMGB1蛋白。目前對(duì)天然蛋白的純化方法，尚處于探

3、索階段。本研究第二部分就分離提純分泌型HMGB1的方法和條件進(jìn)行了初步探索，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)特性奠定基礎(chǔ)。
　　 目的：(1)在課題組前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實(shí)實(shí)體肝細(xì)胞能分泌炎癥因子HMGB1；(2)探討肝細(xì)胞(L02和HepG2)分泌HMGB1的條件，其分泌過程的特點(diǎn)，與免疫細(xì)胞(U937)分泌HMGB1的過程有哪些不同；(3)初步分離純化天然分泌型HMGB1蛋白。
　　 方法：(1)體外用不同濃度LPS刺激L02

4、細(xì)胞，收集不同作用時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞上清液用于Western blot檢測(cè)HMGB1蛋白含量，收集細(xì)胞用于MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，以確定LPS作用的較佳作用時(shí)間點(diǎn)和作用濃度。(2)400ng/mL LPS分別刺激肝細(xì)胞系(L02和HepG2)和免疫細(xì)胞系(U937)，收集(0h，4h，Sh，12h，16h，20h，24h)各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞用于MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率、RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞HMGB1 mRNA、HE染色和DAPI染核觀察細(xì)胞形態(tài)變化、熒

5、光TUNEL和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞免疫熒光觀察HMGB1蛋白移位；同時(shí)收集相應(yīng)上清液用于Western blot檢測(cè)HMGB1蛋白水平和LDH含量檢測(cè)，相應(yīng)對(duì)照組加入等體積生理鹽水。(3)先后用蛋白沉淀法、超濾濃縮法、層析(離子層析、凝膠過濾)等方法分離提純細(xì)胞上清液中的分泌型HMGB1蛋白，并用Western blot、考馬斯亮藍(lán)和銀染等方法進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：(1)體外用不同濃度LPS作用于L02細(xì)胞，其上清

6、中分泌型HMGB1的含量并非嚴(yán)格劑量依賴關(guān)系。當(dāng)LPS作用濃度為0-400ng/mL時(shí)，上清HMGB1蛋白含量隨著LPS濃度的增加而遞增，但LPS刺激濃度增加到800ng/mL時(shí)，其含量反而較400ng/mL時(shí)低。MTT結(jié)果表明細(xì)胞存活率與LPS作用濃度負(fù)相關(guān)，當(dāng)LPS濃度為0-400ng/mL時(shí)，L02細(xì)胞的存活率均在95％以上。(2)終濃度為400ng/mL的LPS作用于L02、HepG2和U937細(xì)胞0-24h，MTT和LDH結(jié)果

7、表明非壞死細(xì)胞占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，與相應(yīng)對(duì)照組比較無顯著性差別(P>0.05)；熒光TUNEL和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS作用0-20h，三組細(xì)胞均未見明顯凋亡，與相應(yīng)對(duì)照組比較無顯著性差別(P>0.05)；HE染色和DAPI染核結(jié)果表明，LPS作用0-24h，三組細(xì)胞與相應(yīng)對(duì)照組比較，在細(xì)胞形態(tài)上無明顯變化。(3)Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS作用8-24h，U937細(xì)胞上清中HMGB1蛋白的含量明顯高于相應(yīng)對(duì)照(P<0

8、.05)；16-24h，HepG2和L02細(xì)胞上清中HMGB1蛋白的含量明顯高于相應(yīng)對(duì)照(P<0.05)；LPS作用20h三種細(xì)胞培養(yǎng)上清HMGB1含量達(dá)到峰值；同時(shí)比較LPS作用下同一個(gè)時(shí)間點(diǎn)三種細(xì)胞分泌HMGB1的量，發(fā)現(xiàn)U937細(xì)胞分泌量占有優(yōu)勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(4)RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)L02和HepG2細(xì)胞于LPS作用20h和24h其HMGB1mRNA表達(dá)水平與相應(yīng)對(duì)照組比較均明顯升高；而U937細(xì)胞，LPS

9、作用12h其HMGB1mRNA表達(dá)水平與相應(yīng)對(duì)照組相比，即有升高，在時(shí)相上先于L02和HepG2細(xì)胞，且升高的幅度也比L02和HepG2細(xì)胞高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(5)細(xì)胞免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)終濃度400ng/mL LPS作用12-24h，HepG2和L02細(xì)胞可見HMGB1蛋白移位；而U937細(xì)胞中HMGB1移位明顯早于HepG2和L02細(xì)胞(P<0.05)。(6)在天然蛋白常規(guī)純化方法中，蛋白沉淀和超濾濃縮不適合用于HM