TRPV1介導大鼠神經病理性疼痛的脊髓機制.pdf

1、背景：
　　神經病理性疼痛是由神經系統(tǒng)的損害或功能紊亂引起的一種常見而特殊的慢性疼痛，以自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和觸誘發(fā)痛為特征。神經病理性疼痛在成年人群的患病率約為5％-25％。神經病理性疼痛不僅給機體帶來了極大的痛苦和負擔，同時也導致了勞動能力的受限，工作效率的降低。但是，由于神經病理性疼痛病因多樣，機制復雜，治療仍然相當困難。據估計，只有不到半數的患者能得到50％以上程度的疼痛緩解。因此，研究和治療神經病理性疼痛，對于提高人群生

2、活質量，具有重要意義。
　　N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體是谷氨酸受體的一個亞型，是一種配體門控型離子通道，在哺乳動物的神經系統(tǒng)具有廣泛的分布。NR2B是NMDA受體的其中一個亞基，對NMDA受體藥理和功能特性起決定性作用。突觸后致密物(PSD)是存在于谷氨酸能突觸后膜中的一種特殊結構，其中一種95 kDa的蛋白質——PSD-95，被發(fā)現與突觸可塑性以及神經病理性疼痛的發(fā)生，具有密切的關系。
　　瞬時感受器電位香草

3、酸受體1（transient receptor potential vanilloid1，TRPV1）屬于瞬時感受器電位（transient receptor potential，TRP）超家族的成員，主要表達在初級傳入感覺神經元上，是一種非選擇性的陽離子通道。TRPV1作為一種與痛覺密切相關的離子通道型受體，在疼痛信號轉導中發(fā)揮著重要作用。近幾年對TRPV1的研究取得了較大進展，在神經病理性疼痛中的作用也越來越受到重視，但是目前為止，

4、仍缺乏相關蛋白質水平的研究。本課題的開展和順利完成可為神經病理性疼痛的機制和治療研究提供新的思路和方向。
　　研究目的：
　　本研究擬采用藥理學手段，RNA干擾技術，形態(tài)學和行為學手段，在大鼠坐骨神經慢性壓迫性損傷（Chronic Constriction Injury，CCI）模型上，探討TRPV1在神經病理性疼痛發(fā)生發(fā)展中的作用及其調制機制，為慢性疼痛的防治提供理論依據。
　　究方法：
　　1.雄性Wista

5、r成年大鼠隨機分為假手術組（Sham組）和CCI組，測定各組大鼠機械痛閾和熱痛閾基礎值后，參考Bennett和Xie等的方法建立大鼠左側CCI模型。 Sham組進行同樣的手術，暴露坐骨神經但不結扎。分別于術后1、2、3、4、5、6、7、10、14、21、28天測定各組大鼠的機械痛閾和熱痛閾。模型動物在深麻醉下處死，取腰膨大段脊髓背角組織，采用免疫印跡(Westernblot)方法檢測TRPV1、NR2B的表達，并用免疫共沉淀（Co-im

6、munoprecipitation， Co-Ip）檢測NR2B和PSD-95的相互作用。
　　2.腰段鞘內置管成功的雄性Wistar成年大鼠隨機分為3組:CCI+二甲基亞砜組（CCI+DMSO組）、CCI+Ro25-698130 nmol/10μl組和CCI+Ro100 nmol/10μl組。Ro25-6981為NR2B的選擇性拮抗劑。CCI術后第7天開始鞘內注射DMSO或Ro25-6981（溶于100％DMSO），觀察NR2B拮

7、抗劑對大鼠機械痛閾和熱痛閾的影響。
　　3.腰段鞘內置管成功的雄性Wistar成年大鼠隨機分為4組:Sham組、CCI組、CCI+DMSO組、CCI+Ro25-6981100 nmol/10μl組。CCI術后第7天開始鞘內注射DMSO或Ro25-6981（溶于100％DMSO），取腰膨大段脊髓背角用Westernblot和Co-Ip檢測TRPV1的表達以及NR2B和PSD-95的相互作用。
　　4.腰段鞘內置管成功的雄性Wi

8、star成年大鼠隨機分為8組:空白對照組（Navie組）、載體對照(PEI)組、RNA干擾（TRPV1-RNAi）后1天組（1d組）、TRPV1-RNAi3天組（3d組）、5天組（5d組）、7天組（7d組）、14天組(14d組)、21天組（21d組）。CCI術后第7天開始鞘內注射PEI或TRPV1-siRNA（溶于PEI），觀察TRPV1-siRNA對脊髓背角TRPV1的沉默效率。
　　5.腰段鞘內置管成功的雄性Wistar成年大

9、鼠隨機分為3組:CCI組、CCI+PEI組、CCI+TRPV1-siRNA5μg/15μl組。CCI術后第7天開始鞘內注射PEI或TRPV1-siRNA（溶于PEI），觀察TRPV1 RNA干擾對大鼠機械痛閾和熱痛閾的影響。
　　究結果：
　　1.術前兩組大鼠機械痛閾和熱痛閾無顯著性差異（P＞0.05），術后第1天，CCI組機械痛閾和熱痛閾較Sham組明顯下降（P＜0.05），持續(xù)至28天以上(P＜0.05)。脊髓腰膨大處T

10、RPV1表達水平測定顯示，術后7天CCI組TRPV1的表達較Sham組顯著性增加（P＜0.05），NR2B的表達未見顯著性變化（P＞0.05）;免疫共沉淀發(fā)現，CCI大鼠脊髓背角NR2B和PSD-95的相互作用顯著性增加（P＜0.05)。
　　2.NR2B拮抗劑給藥前各組大鼠機械痛閾和熱痛閾無顯著性差異(P＞0.05)。在CCI術后第7天開始鞘內注射DMSO或Ro25-6981（溶于100％DMSO）。結果顯示，與溶媒組比較，Ro

11、25-6981100 nmol/d組能顯著性提高大鼠熱痛閾(P＜0.05)，但機械痛閾的變化沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　3.大鼠CCI后7天，鞘內給予NR2B拮抗劑Ro25-6981100 nmol/d連續(xù)3d。Western blot結果顯示，鞘內給予Ro25-6981的大鼠，脊髓背角TRPV1蛋白質的表達降低，與DMSO組比較，差異有顯著性(P＜0.05)。Co-Ip結果顯示，鞘內給予Ro25-6981的大鼠，脊髓背

12、角NR2B和PSD-95的相互作用降低，與DMSO組比較，差異有顯著性(P＜0.05)。
　　4.應用在體RNA干擾技術，對脊髓背角TRPV1進行了基因沉默。Western blot結果顯示，在鞘內轉染TRPV1-siRNA5μg/d，連續(xù)2天，其基因沉默的效率達到50％，作用高峰產生在轉染后1天，隨后，TRPV1的表達逐漸恢復，至第5天達到對照水平。
　　5.打藥前三組大鼠機械痛閾和熱痛閾無顯著性差異(P＞0.05)。 C

13、CI后7天，鞘內給予TRPV1-siRNA5μg/d，連續(xù)2天，觀察了大鼠疼痛閾值的變化。結果顯示，大鼠機械縮足反射閾值和熱縮足反射潛伏期提高。與對照組比較，差異有顯著性(P＜0.05)。
　　結論：
　　1.脊髓背角TRPV1的上調介導了大鼠CCI引起的神經病理性疼痛。
　　2.脊髓背角NR2B通過與PSD-95的相互作用介導了大鼠CCI引起的熱痛覺過敏，但不介導機械痛覺過敏。
　　3.脊髓背角TRPV1的上調