脊髓水平mTOR信號(hào)在小鼠神經(jīng)病理性疼痛中作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：探討連續(xù)鞘內(nèi)注射雷帕霉素(Rapamycin)對(duì)小鼠神經(jīng)病理性痛行為的影響以及脊髓水平mTOR信號(hào)通路在CCI誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛中的作用機(jī)制。
　　方法：痛行為學(xué)實(shí)驗(yàn)：選擇鞘內(nèi)置管成功、無(wú)運(yùn)動(dòng)障礙及嚴(yán)重體重減輕的成年雄性C57/BL6小鼠48只，隨機(jī)分為兩組：假手術(shù)組(sham組，n=24)和慢性坐骨神經(jīng)損傷模型組(CCI組，n=24)。建立模型后將各組隨機(jī)分為三組，組一不做任何處理，組二在術(shù)后1－6d鞘內(nèi)注射雷帕霉素1μ

2、g/5μl，組三鞘內(nèi)給予溶媒20％DMSO5μl(sham，sham+R，sham+V，CCI，CCI+R，CCI+V，n=8)。在術(shù)前1d，術(shù)后1d，3d，5d，7d，10d，14d，17d，21d，28d檢測(cè)小鼠雙側(cè)足底機(jī)械縮足閾值(Paw MechanicalWithdraw Threshold，PWMT)和熱輻射縮足潛伏期(Paw Thermal WithdrawLatency，PTWL)。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：在未接受藥物干預(yù)的sh

3、am組第7d以及CCI術(shù)后1d，3d，5d，7d，10d，14d，17d，21d，深麻醉狀態(tài)下以頸椎脫臼的方式處死小鼠，取L4～5節(jié)段脊髓保存于－80℃冰箱，待用Western blot檢測(cè)脊髓水平磷酸化mTOR(Ser2448)和總的mTOR的時(shí)間依賴(lài)的表達(dá)量。雷帕霉素干預(yù)后，各組于第7d，14d處死小鼠，取L4～5節(jié)段脊髓保存于－80℃冰箱，待用Western blot檢測(cè)脊髓水平mTOR信號(hào)蛋白[t-mTOR/p-mTOR，t－4

4、EBP1/p一4EBP1(thr-37/46)，t-p70S6K/p-p70S6k(thr-389)]和PSD95的表達(dá)變化，以及待用Co-immunoprecipatation檢測(cè)PSD95與NR2B，PSD95與GluA2的相互作用。
　　結(jié)果：(1)痛行為學(xué)變化：與sham組相比，CCI組小鼠手術(shù)側(cè)足底PTWL和PMWT均明顯降低[第7d，PTWL：(7.03±0.71)，(3.26±0.66)s，F(xiàn)=38.27，P<0.0

5、5；PMWT：(1.02±0.12)，(0.42±0.12)g，F(xiàn)=51.01，P<0.05；]。而CCI后1－6d鞘內(nèi)注射雷帕霉素1μg/5μl，使小鼠的PMWT明顯升高[第7d，(0.42±0.18)，(0.86±0.25)g，F(xiàn)=6.56，P<0.05]，并且至少持續(xù)至術(shù)后10d。然而，雷帕霉素對(duì)CCI小鼠的熱痛覺(jué)過(guò)敏僅有緩解趨勢(shì)，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。sham組和對(duì)側(cè)足底痛行為未見(jiàn)明顯改變(P>0.05)。(2)分子生物學(xué)結(jié)果：與sh

6、am組相比，脊髓水平p-mTOR的表達(dá)于CCI后1d開(kāi)始表達(dá)增加，第10d達(dá)峰值，之后表達(dá)下調(diào)但21d時(shí)仍處于較高水平。而t-mTOR未見(jiàn)明顯改變。與溶媒組相比，鞘內(nèi)注射雷帕霉素組脊髓水平p-mTOR，p-4EBP1，p-p70S6K以及PSD95的表達(dá)下調(diào)，而t-mTOR，t－4EBP1，t-p70S6K表達(dá)無(wú)明顯差異。Co-immunoprecipatation結(jié)果顯示，CCI后PSD95與NR2B以及GluA2的相互作用在第7d增

7、加，而PSD95與GluA2相互作用的增強(qiáng)持續(xù)至第10d。雷帕霉素同樣可以抑制這種相互作用的增強(qiáng)。
　　結(jié)論：CCI誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛小鼠脊髓水平mTOR信號(hào)途徑相關(guān)蛋白活化形式表達(dá)明顯增加，鞘內(nèi)注射mTOR特異性抑制劑雷帕霉素可以抑制各種蛋白的活化并且可有效緩解CCI小鼠的機(jī)械痛覺(jué)異常。脊髓水平mTOR信號(hào)在CCI誘發(fā)的持續(xù)性疼痛中發(fā)揮重要作用。CCI后1－6d鞘內(nèi)注射雷帕霉素降低了脊髓水平PSD95表達(dá)量以及PSD95介導(dǎo)的