脊髓背角自噬對大鼠神經(jīng)病理性疼痛的影響及機制研究.pdf

1、本文分三個部分進行探討：
　　第一部分：脊神經(jīng)結扎神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠脊髓背角自噬的變化
　　目的：建立大鼠脊神經(jīng)結扎神經(jīng)病理性疼痛模型，并觀察大鼠脊髓背角自噬的變化。
　　方法：雄性SD大鼠（200 g~220 g）60只，隨機分為兩組(n=30)：假手術組(sham組)和脊神經(jīng)結扎組(SNL組)。SNL組大鼠行左側腰5脊神經(jīng)結扎術，sham組大鼠僅暴露并分離左側腰5脊神經(jīng)。測定各組大鼠術前1 d（基礎值）和術后1

2、，3，5，7 d機械痛閾（PWT）和熱痛閾（PWL）。每組大鼠于術后1，3，5，7 d隨機取6只處死，Western blot法檢測大鼠左側腰5脊髓背角微管相關輕鏈蛋白3（LC3）和泛素結合蛋白p62的表達。SNL組大鼠在術后第7 d隨機取4只處死，取左側腰5脊髓背角行p62/NeuN、p62/GFAP、p62/CD11b雙重免疫熒光標記染色。
　　結果：和sham組相比，SNL組大鼠PWT和PWL分別在術后第1天和第3天明顯降低

3、，并持續(xù)到第7天(P<0.05)，脊髓LC3-Ⅱ、p62表達明顯增高(P<0.05)。雙重免疫熒光標記染色結果顯示p62與NeuN、CD11b共表達。
　　結論：成功建立了大鼠脊神經(jīng)結扎神經(jīng)病理性疼痛模型，脊髓背角神經(jīng)元和小膠質細胞自噬受損可能參與了脊神經(jīng)結扎引起的大鼠神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展。
　　第二部分：調節(jié)自噬對神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛閾及脊髓背角白介素-1β的影響
　　目的：研究上調或抑制自噬對神經(jīng)病理性疼痛大

4、鼠痛閾及脊髓背角白介素-1β的影響。
　　方法：雄性SD大鼠（200 g~220 g）60只，隨機分為4組(n=15)：假手術組(sham組)，脊神經(jīng)結扎組(SNL組)，雷帕霉素處理組（Rap組）和3-甲基腺嘌呤（3-MA）處理組（3-MA組）。各組大鼠經(jīng)L4-5鞘內(nèi)置管后，SNL組、Rap和3-MA組大鼠行左側腰5脊神經(jīng)結扎術，sham組大鼠分離左側腰5脊神經(jīng)但不結扎。Rap組和3-MA組大鼠于SNL術后30 min分別經(jīng)鞘內(nèi)置

5、管給予雷帕霉素0.1μg和3-MA30μg；sham組和SNL組大鼠則給與等容溶劑（5％DMSO10μl）。每日一次，連續(xù)7天。測定各組大鼠術前1 d（基礎值）和術后1，3，5，7 d機械痛閾（PWT）和熱痛閾（PWL）。7 d后處死大鼠，各組取6只Western blot檢測大鼠左側腰5脊髓背角微管相關輕鏈蛋白3（LC3）和泛素結合蛋白p62的表達；取3只大鼠在透射電鏡下觀察左側脊髓背角小膠質細胞自噬體；取6只大鼠ELISA法檢測大鼠

6、左側腰5脊髓背角白介素-1β（IL-1β）水平。
　　結果：和sham組相比，SNL組大鼠PWT和PWL明顯降低(P<0.05)，脊髓LC3-Ⅱ、p62及IL-1β表達明顯增高(P<0.05)。和SNL組相比，Rap組大鼠PWT、PWL、脊髓LC3-Ⅱ和小膠質細胞自噬體明顯升高(P<0.05)，p62和IL-1β表達明顯降低(P<0.05)；而3-MA組大鼠PWT、PWL、脊髓LC3-Ⅱ和小膠質細胞自噬體明顯降低(P<0.05)，

7、p62和IL-1β表達明顯增高(P<0.05)。
　　結論：上調自噬能減輕神經(jīng)病理性疼痛，而抑制自噬加重神經(jīng)病理性疼痛；其機制與脊髓背角小膠質細胞自噬對脊髓背角IL-1β水平的影響有關。
　　第三部分：調節(jié)自噬對神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角神經(jīng)元凋亡的影響
　　目的：研究調節(jié)自噬對神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角神經(jīng)元凋亡的影響
　　方法：實驗1.30只SD大鼠鞘內(nèi)置管后隨機分為3組(n=10)：假手術組(sham組)，

8、脊神經(jīng)結扎組(SNL組)，雷帕霉素處理組（Rap組）。Sham組大鼠分離左側腰5脊神經(jīng)但不結扎，Rap組大鼠于SNL術后30 min經(jīng)鞘內(nèi)置管給予雷帕霉素0.1μg， Sham組和SNL組大鼠則給予等容溶劑（5％DMSO10μl）。藥物每日鞘內(nèi)注射一次，連續(xù)7天。
　　實驗2.30只SD大鼠鞘內(nèi)置管后隨機分為3組(n=10)：假手術組(sham組)，脊神經(jīng)結扎組(SNL組)，3-甲基腺嘌呤（3-MA）處理組（3-MA組）。Sham

9、組大鼠分離左側腰5脊神經(jīng)但不結扎，3-MA組大鼠于SNL術后30 min經(jīng)鞘內(nèi)置管給予3-MA30μg。Sham組和3-MA組大鼠則給予等容溶劑（5％DMSO10μl）。藥物每日鞘內(nèi)注射一次，連續(xù)3天。
　　實驗1和實驗2分別于SNL術后7 d和3 d處死大鼠并取左側腰5脊髓背角。各組取3只透射電鏡下觀察神經(jīng)元，剩余7只大鼠用Western blot法檢測脊髓背角活化的caspase3和NeuN表達。
　　結果：實驗1：和s

10、ham組相比，電鏡下SNL組大鼠脊髓背角神經(jīng)元受損明顯，caspase3明顯增高(P<0.05)，NeuN明顯降低(P<0.05)；和SNL相比，電鏡下Rap組脊髓背角神經(jīng)元受損較輕，自噬體增多，caspase3明顯降低(P<0.05)，NeuN明顯增高(P<0.05)。
　　實驗2：和sham組相比，電鏡下SNL組大鼠脊髓背角神經(jīng)元受損明顯，caspase3明顯增高(P<0.05)，而NeuN未見明顯變化；和SNL相比，電鏡下3