脂肪源性干細胞和成纖維細胞聯(lián)合移植治療大鼠壓力性尿失禁的實驗研究.pdf

1、目的：
　　1.體外分離培養(yǎng)大鼠脂肪源性干細胞（Adipose-derived stromal cells,ADSCs）和成纖維細胞；
　　2.建立壓力性尿失禁（Stress urinary incontinence,SUI）模型，觀察不同數(shù)量的異體ADSCs和成纖維細胞聯(lián)合移植于尿道中段周圍后對尿動力學指標的影響及細胞注射后尿道及周圍組織的形態(tài)學變化，比較各組對壓力性尿失禁的治療效果。
　　方法：
　　1.采用

2、膠原酶I分離提取大鼠ADSCs，經(jīng)流式細胞儀對表面標志物進行鑒定；采用改良式兩步酶消化法獲取成纖維細胞，用免疫組織化學法將其鑒定；根據(jù)不同細胞群貼壁能力的差異使用差速貼壁離心法使兩者純化；利用倒置相差顯微鏡觀察細胞的增殖情況及形態(tài)學變化，為后續(xù)實驗提供理想的細胞源。
　　2.36只SD雌性未孕大鼠隨機分為兩組：正常組6只,未造模且未行注射治療；實驗組30只進行陰道持續(xù)擴張和雙側(cè)卵巢切除術，2周后所有大鼠均用BL-420生物機能檢測

3、儀測定最大膀胱容量和腹壓漏尿點壓力，驗證模型均建立成功。
　　3.將造模成功后1個月的所有實驗組大鼠又隨機分為5組（6只/組）。在顯微鏡下將40uL的細胞數(shù)量分別為1×104、1×105、1×106的ADSCs和成纖維細胞混懸液分別移植于大鼠尿道中段周圍的3點和9點處，而生理鹽水作為對照組，并設立空白組，術后1個月進行尿動力學指標檢測，評估對壓力性尿失禁的治療效果。
　　4.細胞移植1個月后處死大鼠，將尿道及陰道前壁組織進行

4、取材，采用HE染色評價細胞移植后尿道周圍組織病理變化。
　　5.統(tǒng)計學方法：采用SPSS13.0進行數(shù)據(jù)處理，計量資料采用(x)±s表示。若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布和方差齊時，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法；不滿足則采用秩和檢驗。以α=0.05為檢驗水準。
　　結(jié)果：
　　1.體外培養(yǎng)的ADSCs呈多角形或梭形的漩渦狀細胞集落，形態(tài)均一，細胞表達CD29、CD44，不表達CD45，陽

5、性率分別為96.63％、78.53%和0.75%。體外培養(yǎng)的成纖維細胞與ADSCs形態(tài)相似，經(jīng)免疫組化鑒定，波形蛋白表達陽性，定位于胞質(zhì)，而角蛋白表達陰性。經(jīng)倒置相差顯微鏡觀察，大鼠ADSCs和成纖維細胞經(jīng)第三次傳代后，細胞形態(tài)無明顯變化，仍保持較強的分裂增殖活力。
　　2.陰道持續(xù)擴張加雙側(cè)卵巢切除能夠成功建立SUI動物模型。實驗組與正常組的最大膀胱容量（ml）分別為1.83±0.54、3.08±0.28，腹壓漏尿點壓力（cmH

6、2O）為76.02±2.56、24.91±2.94，實驗組較正常組明顯降低（P＜0.001）。
　　3.將不同數(shù)量的ADSCs和成纖維細胞聯(lián)合移植1個月后，經(jīng)尿動力學檢測，正常組、SUI組、生理鹽水組、1×104組、1×105組、1×106組最大膀胱容量（ml）分別為3.08±0.28、1.89±0.36、1.93±0.60、2.10±0.55、2.23±0.66和2.54±0.38，組間比較示：正常組與其余各組均有統(tǒng)計學差異（P

7、＜0.001），1×106組與SUI組、生理鹽水組比較有差異，其余各組間比較均無差異（P＞0.05）；各組腹壓漏尿點壓力（cmH2O）分別為76.02±2.56、26.26±3.01、29.17±4.09、32.96±4.99、36.82±4.22和41.16±3.57，組間比較示：正常組與其余各組均有差異（P＜0.001），但SUI組與生理鹽水組無差異（P＞0.05），1×104組與SUI組有差異，1×105組與SUI組、生理鹽水組有

8、差異，1×106組與SUI組、生理鹽水組和1×104組均有差異（P＜0.001）。
　　4.不同數(shù)量的ADSCs和成纖維細胞聯(lián)合移植后各組尿道及周圍組織的形態(tài)學變化：正常組尿道有完整的肌層結(jié)構(gòu)，肌纖維呈束狀緊密排列。SUI組尿道肌層受損，排列紊亂并變薄，且肌纖維之間出現(xiàn)松散、斷裂及萎縮現(xiàn)象。而生理鹽水組無明顯變化，但尿道形成瘢痕及纖維化。細胞移植組，移植局部尿道肌層明顯增厚（P＜0.01），肌纖維排列仍相對松散和紊亂，周圍結(jié)締組織

9、變緊密，但是細胞各數(shù)量級間未見明顯差異(P＞0.05)。正常組陰道前壁可見清晰的粘膜層、肌層和外膜層結(jié)構(gòu)，平滑肌束粗大，呈編織狀，膠原含量豐富、致密。SUI組肌層較薄，面積變小，肌纖維之間失去正常的連接結(jié)構(gòu)，肌束間隙增寬，膠原纖維散在分布且出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象。生理鹽水組和細胞移植組均未見明顯變化(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.通過差速貼壁法和膠原酶消化法可獲得純度較高、生物活性較好的脂肪源性干細胞；采用差速貼壁結(jié)合改良式兩