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文檔簡介
1、目的:探討慢病毒載體介導(dǎo)的胰島素樣生長因子-1(IGF-1)基因修飾的肌源性干細胞(MDSCs)移植對雌性壓力性尿失禁大鼠模型的作用及可能機制,為細胞移植策略治療女性壓力性尿失禁提供新的理論依據(jù)。
方法:1、體外原代MDSCs的分離、純化、分化和鑒定。取Wistar大鼠腓腸肌,機械法和酶消化法后,采用改良差速貼壁法純化大鼠原代MDSCs,通過倒置相差顯微鏡觀察細胞的生長形態(tài)和分化情況,采用流式細胞儀術(shù)、細胞免疫熒光化學(xué)、免疫細
2、胞化學(xué)對P3-MDSCs進行表型鑒定,同時對分化培養(yǎng)的P3-MDSCs進行MyHC蛋白檢測。2、采用體外重組(in-fusion)技術(shù),以攜帶增強型綠色熒光蛋白(eGFP)的pGC-FU慢病毒載體系統(tǒng)作為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的媒介,構(gòu)建攜帶IGF-1基因重組的慢病毒表達載體(pGC-FU-IGF-1),通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)、酶切和測序的方式鑒定所構(gòu)建的載體并轉(zhuǎn)染293T細胞,以熒光顯微鏡觀察綠色熒光,以Western blot檢測GFP蛋白
3、的表達,以實時定量熒光PCR(RT-QPCR)檢測慢病毒的滴度。將攜帶有IGF-1&eGFP融合基因的慢病毒和僅攜帶eGFP的慢病毒感染大鼠MDSCs(分別為IGF-1/MDSCs組和GFP/MDSCs組),通過熒光表達情況以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)結(jié)果確定最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)。3、取最佳MOI慢病毒感染MDSCs,待IGF-1/MDSCs組和GFP/MDSCs組達到90%融合后,模擬體內(nèi)氧化應(yīng)激微環(huán)境,體外建立過氧化氫(H2
4、O2)誘導(dǎo)細胞凋亡模型,MTS法檢測不同濃度不同時間的H2O2干預(yù)對MDSCs活性的影響,并通過流式、DNA ladder探討H2O2對MDSCs凋亡的影響;Western blot檢測MDSCs內(nèi)抗凋亡相關(guān)蛋白P-AKT、NFκB、Bcl-2以及Bcl-xl與凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、PARP的表達情況,探討IGF-1基因修飾的MDSCs抑制細胞凋亡的可能機制。4、采用雙側(cè)陰部神經(jīng)橫斷法(PNT)建立雌性壓力性尿失禁大鼠模型,6
5、0只成年雌性大鼠隨機均分為假手術(shù)組(S組)、溶劑對照組(PBS組)、空病毒感染的MDSCs移植組(GFP/MDSCs組)和IGF-1基因修飾的MDSCs移植組(IGF-1/MDSCs組),以1×106個/只細胞數(shù)注入尿道距膀胱約0.5cm處,每組再按治療后1、2、4周分為3個亞組(每組5只)。采用尿動力學(xué)評價造模成功與否,并評價注射治療1、2、4周后尿道閉合功能情況。注射治療1周后,采用激光共聚焦掃描顯微鏡評價移植細胞存活情況。注射治療
6、4周后,免疫組織化學(xué)評價近端尿道毛細血管生成情況;伊紅-蘇木素(HE)及Masson染色評價近端尿道組織病理學(xué)改變;多重免疫熒光技術(shù)評價移植細胞的分化情況。在注射治療的各個時間點,免疫組織化學(xué)和Western blot檢測胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)的表達情況。
結(jié)果:1、所分離培養(yǎng)的MDSCs具有低粘附性、小圓形、折光性強的生物學(xué)特性,可以形成肌管,細胞表型鑒定為Sca-l(+)、CD
7、34(+)、CD45(-)和desmin(+),符合MDSCs的特征。2、所構(gòu)建的IGF-1&eGFP重組慢病毒載體,經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定完全正確,轉(zhuǎn)染293T細胞后能夠正常表達,測得病毒滴度為2×108TU/ml。慢病毒感染MDSCs后,隨著MOI值的增加,熒光強度逐漸增強,并伴隨IGF-1分泌水平顯著增加(p﹤0.01)。3、低溶度(﹤200 uM)、短時間的H2O2(﹤0.5h)干預(yù)對MDSCs的活性無明顯影響(p>0.05)
8、,隨著H2O2濃度的增加,作用時間的延長,MDSCs的活性顯著下降(p﹤0.01),其中,GFP/MDSCs組下降更為明顯(p﹤0.01)。通過DNA ladder凝膠電泳以及流式細胞儀雙染檢測分析,發(fā)現(xiàn)H2O2能夠誘導(dǎo)MDSCs caspase酶依賴性凋亡,而IGF-1能夠拮抗H2O2作用,上調(diào)抗凋亡相關(guān)蛋白P-AKT、NFκB、Bcl-2以及Bcl-xl的表達(p﹤0.05),降低caspase-3、PARP的水解程度(p﹤0.01
9、)。4、成功構(gòu)建壓力性尿失禁大鼠模型。細胞注射治療1周后,IGF-1/MDSCs組的細胞存活率顯著高于GFP/MDSCs組(p﹤0.01),4周后,移植的細胞可以分化為MyHC,其中IGF-1/MDSCs組的細胞分化強度強于GFP/MDSCs組。IGF-1/MDSCs組和GFP/MDSCs組在細胞治療1、2、4周后無論是膀胱最大容量(MBC)還是腹壓漏尿點壓力(ALPP)均顯著高于PBS組(p﹤0.01),低于假手術(shù)組(p>0.05),
10、其中IGF-1/MDSC組略高于GFP/MDSCs組(p>0.05)。治療4周后,IGF-1/MDSCs組新生的毛細血管密度顯著高于GFP/MDSCs組(p﹤0.01),后者又高于PBS組及S組(p﹤0.01)。細胞治療的各個時間點,IGF-1/MDSCs組的IGF-1和VEGF蛋白表達量與各組比較顯著升高(p﹤0.01),而GFP/MDSCs組在細胞治療1、2周后,明顯高于S組及PBS組(p﹤0.01),4周后,降至正常水平(p>0.
11、05)。組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn):IGF-1/ MDSCs組有較多新生血管及肌纖維形成,GFP/MDSCs組可見部分新生肌纖維和少許新生血管,PBS組可見尿道平滑肌、橫紋肌層變性、萎縮,血管減少。定量肌/膠原比率發(fā)現(xiàn):S組﹥IGF-1/MDSCs組﹥GFP/MDSCs組﹥PBS組(p﹤0.05)。
結(jié)論:本研究可以從Wistar大鼠中成功分離出純度較高的MDSCs;成功構(gòu)建IGF-1&eGFP融合基因重組慢病毒表達載體,并能夠安全有
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