人多能干細胞分化而來的平滑肌前體細胞治療壓力性尿失禁大鼠的研究.pdf

1、壓力性尿失禁（Stress urinary incontinence，SUI）是指在咳嗽、噴嚏、大笑等腹壓增高時出現(xiàn)的不自主地尿液滲漏。SUI是女性最為常見的尿失禁類型，尤其是老年婦女。SUI癥狀經(jīng)常發(fā)生在日常活動中，因此嚴重影響患者的生活質(zhì)量和社交活動，亦帶來心理精神負擔。SUI發(fā)病機制尚不明確，但尿道固有括約肌功能不全（Intrinsic sphincter deficiency，ISD）是導致SUI的重要因素。ISD主要由于尿道括

2、約肌的平滑肌層或橫紋肌層或其支配神經(jīng)出現(xiàn)損傷引起。具有ISD的SUI患者通常有更嚴重的尿失禁癥狀，且對常規(guī)的治療反應(yīng)不佳。當保守治療失敗后，必須進行手術(shù)治療。目前首選的手術(shù)治療方式，如中段尿道懸吊術(shù)等，僅是增加對尿道的支持、固定作用，并不涉及對損傷或老化的尿道括約肌進行組織重建。而這類手術(shù)的長期成功率約為40-50％，有很大一部分患者會出現(xiàn)術(shù)后復發(fā)的情況。手術(shù)的局限性及逐漸進展的尿道括約肌平滑肌層老化衰退被認為是導致術(shù)后復發(fā)的原因。因此

3、，有效恢復受損的尿道括約肌是需要積極探索的重要治療方式。
　　干細胞因其具備自我更新和多向分化的潛能，可應(yīng)用于SUI患者的尿道括約肌再生，這引起了研究領(lǐng)域的極大興趣。目前，已有成體干細胞（肌肉來源、泌尿系來源、脂肪來源、骨髓來源等）在SUI動物研究或臨床研究中表現(xiàn)出在排尿功能的恢復、組織學的改善方面有較好的效果。但是，這些成體干細胞的臨床應(yīng)用仍存在眾多問題，如提取的自體干細胞數(shù)量有限、細胞擴增準備時間過長、移植細胞為多種細胞類型混

4、合、攜帶表觀遺傳改變等等。這些障礙不利于干細胞療效的優(yōu)化，也影響了我們對干細胞具體作用機制進行深入研究。因此，為避免上述問題，人胚胎干細胞或誘導多能干細胞或許可以成為新的干細胞來源。另外，現(xiàn)階段的干細胞實驗主要修復的是尿道外括約肌（橫紋?。形从袃H針對尿道內(nèi)括約?。ㄆ交。┰偕难芯繄蟮?。研究人員發(fā)現(xiàn)，在SUI研究中應(yīng)用最廣的成體間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)僅有一小部分能夠分化為平滑肌細胞，而由于成體間充質(zhì)干細胞移植混雜有多種細胞類型，分化而來

5、的平滑肌細胞是否對尿道括約肌功能重建有促進作用及有關(guān)機制都無法明確。
　　目的:我們試圖探索人胚胎干細胞和人誘導多能干細胞(Induced pluripotent stemcells，iPSCs)分化而來的單一平滑肌前體細胞(Progenitor smooth muscle cells，pSMCs)對重建SUI動物模型尿道功能的作用及機制。首先，通過在不同時間點對不同SUI大鼠建模方式的建模效果進行比較，以期找到更穩(wěn)定更適宜干細胞

6、移植研究的長期SUI模型。在此基礎(chǔ)上，分化而來的pSMCs在移植入SUI大鼠尿道周圍一段時間后，根據(jù)LPP和尿道外周括約肌肌電圖（Electromyography，EMG）基線的測試，判斷尿道功能的恢復情況。根據(jù)尿道括約肌組織學檢查、細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)主要組成彈性纖維和膠原纖維的蛋白比較、移植細胞體內(nèi)融合實驗等分析平滑肌前體細胞恢復尿道功能的作用機制。
　　方法:1、根據(jù)終末觀察時間的不

7、同將150只產(chǎn)后SD大鼠隨機分為三個獨立實驗:1周短期觀察實驗、4周和8周長期觀察實驗。每個實驗中，大鼠隨機分為對照組、尿道松解組、恥骨-尿道韌帶損傷（Pubo-urethral ligament injury，PULI）組和多次陰道球囊擴張組(Multiple vaginal distention，MVD)。除對照組及1周短期實驗中的尿道松解組和PULI組外，其余組均在手術(shù)的同時附加了雙側(cè)輸卵管卵巢切除術(shù)(Bilateral salp

8、ingo-oophorectomy，BSO)。1周短期觀察實驗通過Crede法對三個時間點進行漏尿點壓力(Leak point pressure，LPP)測試:術(shù)前、術(shù)后立即和術(shù)后一周。4周和8周長期觀察實驗通過Crede法和垂直-傾斜板(vertical tilt tabel，VT)法在術(shù)后4周和8周的終末時間點對LPP進行測試。術(shù)后8周LPP測試后收集大鼠的尿道進行組織學分析。2、108只成年未經(jīng)產(chǎn)的Rowett裸鼠隨機分為四組:對

9、照組（無干預）、生理鹽水組（手術(shù)+生理鹽水注射）、膀胱平滑肌細胞(Bladder smoothmuscle cells，BSMC)組（手術(shù)+人BSMC注射）、平滑肌前體細胞(pSMCs)處理組（手術(shù)+pSMCs注射，包括人胚胎干細胞H9、游離型載體介導重編程的iPSC（Episomal reprogrammed induced pluripotent stem cells，Epi-iPSC）、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導重編程的iPSC分化而來的pS

10、MCs）。根據(jù)第一部分實驗得出的更好的SUI建模方式對Rowett nude(RNU)大鼠進行手術(shù)。手術(shù)后3周，在尿道周圍注射分化好的平滑肌前體細胞（2×106個細胞/只）。注射5周后測試LPP和尿道外周括約肌EMG基線。3、對H9-pSMCs實驗中的四組（正常對照組、生理鹽水組、BSMC組、H9-pSMCs組）的尿道組織，進行平滑肌特異性蛋白、骨骼肌肌動蛋白雙重免疫熒光染色，評價尿道括約肌肌層的變化;進行彈性纖維、膠原蛋白雙重染色，評

11、價尿道ECM結(jié)構(gòu)的變化;RT-qPCR檢測大鼠尿道組織中的人彈性蛋白、人ERV-3，判斷H9-pSMC是否在大鼠體內(nèi)大量增殖及分化;Western Blot比較四組大鼠尿道組織中的彈性蛋白、膠原蛋白Ⅲ含量，對組織學結(jié)果進行驗證;在5只SCID小鼠單側(cè)后肢長收肌注射熒光素標記的1×106H9-pSMCs，進行體內(nèi)生物信號BLI追蹤，并對注射部位的組織進行切片染色檢測pSMCs移植后的融合情況。
　　結(jié)果:1、在1周觀察實驗中，尿道松

12、解組術(shù)后立即（33.69±2.27 cmH2O）和術(shù)后1周時的LPP（39.34±2.08 cmH2O）與術(shù)前（50.40±1.99 cmH2O）(p＜0.05)相比顯著降低。MVD+BSO組的術(shù)后一周LPP(35.17±1.76 cmH2O)與術(shù)前(49.39±4.44 cmH2O)(p＜0.05)相比也有同樣的結(jié)果;在4周觀察實驗中，各組與對照組相比均沒有顯著差異;而在術(shù)后8周時，僅有尿道松解組經(jīng)VT法測得的的LPP與對照組相比顯著

13、降低(28.26±1.11 vs38.89±3.91 cmH2O)(P＜0.05)，其余組LPP均無差異。組織學結(jié)果也證實術(shù)后8周時，尿道松解組尿道中的彈力纖維和膠原纖維破壞得最為嚴重。2、iPSC分化而來的平滑肌前體細胞處理組，不論是游離型載體方法重編程的iPSC(N=9，mean=19.4±1.33 cm H2O)，還是逆轉(zhuǎn)錄病毒方法重編程的iPSC(N=8，mean=18.45±1.41 cm H2O)，與生理鹽水組(N=14，m

14、ean=14.16±1.07 cm H2O)(p＜0.05)相比，LPP顯著升高，與尿道功能恢復相一致。而H9分化的平滑肌細胞處理組的LPP(N=22，mean=16.66±0.74 cm H2O)與生理鹽水組(N=10，mean=15.52±1.09 cm H2O)的差異并不顯著，但仍然顯示出了其LPP向正常對照組的LPP水平(N=13，mean=18.75±0.96cm H2O)靠攏的發(fā)展趨勢。3、尿道組織學顯示H9-pSMCs處理

15、的大鼠尿道與生理鹽水組相比具有更豐富的彈性纖維和更厚的肌層。Western blot結(jié)果證實H9-pSMCs處理組的大鼠尿道和膀胱中的彈性蛋白、膠原蛋白含量顯著增加。人彈性蛋白的基因表達在大鼠尿道組織中未檢測到，說明細胞外基質(zhì)的合成是來源于大鼠自身組織，而不是移植的人類細胞。嚴重聯(lián)合免疫缺陷(Severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠的體內(nèi)pSMCs生物信號追蹤和免疫熒光染色結(jié)果證明pSMCs可以長

16、期存活，并融合入SCID小鼠組織且表達平滑肌細胞表型。
　　結(jié)論:尿道松解術(shù)方法建立的SUI大鼠模型較為穩(wěn)定，更適宜干細胞移植研究;人多能干細胞（hESC和iPSC）分化而來的平滑肌前體細胞可以恢復括約肌功能，這一發(fā)現(xiàn)為多能干細胞分化大量平滑肌細胞用于泌尿系統(tǒng)的功能恢復提供了可能性;H9-pSMC的尿道周移植能夠促進大鼠受損尿道的結(jié)構(gòu)重建，其作用機制包括通過旁分泌調(diào)節(jié)ECM代謝、刺激自身括約肌修復、pSMC可能增殖并整合入再生的括

17、約肌肌層。本研究首次揭示人多能干細胞(H9hESC、iPSCs、Epi-iPSCs)來源的pSMCs能夠恢復SUI大鼠的尿道功能。iPSCs來自自體細胞，能夠減少宿主免疫排斥反應(yīng)，同時也避免了hESCs應(yīng)用的倫理問題。本研究使用的iPSCs有兩種誘導方式，一種是通過逆轉(zhuǎn)錄病毒，這種方式可以使病毒顆粒整合到宿主基因組中，導致基因突變，因而不能應(yīng)用于臨床，另一種是通過非整合方式誘導完成的Epi-iPSCs，對人體相對無害。因此，Epi-iP