自體骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞注射治療女性壓力性尿失禁的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究的目的是建立大鼠骨骼肌衛(wèi)星的原代分離、純化方法，觀察大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的體外增殖、成肌特性。 研究方法：(D采用膠原酶、胰蛋白酶改良兩步酶消化法，分離獲取大鼠骨骼肌組織中的單個(gè)核細(xì)胞，利用不同細(xì)胞群貼壁能力的差異，通過(guò)差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞，使骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞得以純化。(2)倒置相差顯微鏡觀察體外培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的增殖情況和形態(tài)的變化。(3)免疫組化鑒定所分離的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞肌性標(biāo)志desmin。(4)倒置相差顯微鏡下

2、觀察不同處理?xiàng)l件下原代分離的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的成肌特性。 研究結(jié)果：(1)改良兩步酶消化法結(jié)合差速貼壁技術(shù)，可以分離得到較高純度的大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，Desmin免疫組化鑒定純度在85％以上。(2)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞貼壁速度慢，培養(yǎng)皿需要用多聚賴氨酸處理，細(xì)胞接種24小時(shí)后大多數(shù)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞完成貼壁。細(xì)胞形態(tài)呈梭形，與成纖維細(xì)胞形態(tài)相似，屬纖維細(xì)胞型。(4)成肌特性觀察：當(dāng)細(xì)胞密度較大(生長(zhǎng)匯合至60％-70％)或降低培養(yǎng)基血清濃度

3、(含2％胎牛血清和2％馬血清的DMEM培養(yǎng)基)，細(xì)胞之間開始相互融合形成肌管細(xì)胞。所形成的肌管細(xì)胞具有多細(xì)胞核特征，肌管細(xì)胞之間也可以相互融合，外觀形態(tài)上更加粗大，最終可連接成網(wǎng)狀。在培養(yǎng)條件良好時(shí)有時(shí)可以觀察到肌管細(xì)胞的自發(fā)收縮。 研究結(jié)論：改良兩步酶消化法結(jié)合差速貼壁技術(shù)是一種簡(jiǎn)便易行、獲得較高純度骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的方法。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)無(wú)需特殊誘導(dǎo)即可相互融合，形成具有自發(fā)收縮特性的多細(xì)胞核肌管細(xì)胞。 研究目

4、的：IGF-1對(duì)大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖刺激效應(yīng)。探討IGF-1刺激骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的機(jī)理。 研究方法：(1)IGF-1對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖刺激效應(yīng)。IGF-1分為2ng／ml，20ng／ml，50ng／ml，100ng／ml共四組，并設(shè)置空白對(duì)照組(不加IGF-1)。培養(yǎng)24、48小時(shí)，MTF法觀察不同濃度的IGF-1在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖刺激效應(yīng)。(2)western-blotting檢測(cè)IGF-1刺激骨骼肌

5、衛(wèi)星細(xì)胞后P13K信號(hào)通路效應(yīng)分子的改變。取原代分離后傳第二代骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞接種于10em培養(yǎng)皿，DMEM增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞增殖到30％-．-40％匯合后實(shí)驗(yàn)。分三組：空白對(duì)照組(5％FBS)，IGF-1組(5％FBS+20ng／mlIGF-1)，IGF-I+LY294002組(5％FBS+20ng／mlIGF-1+20uMLY294002)。無(wú)血清培養(yǎng)基同步化處理16小時(shí)后，加入相應(yīng)的干預(yù)因素，其中LY294002組在更換培養(yǎng)基前用L

6、Y294002(20uM)預(yù)處理1小時(shí)。干預(yù)因素處理2小時(shí)后，抽提蛋白，western-blotting測(cè)定FOX01、磷酸化FOX01以及P27Kipl蛋白水平表達(dá)的改變。共收集5份標(biāo)本實(shí)驗(yàn)。(3)RT-PCR同時(shí)檢測(cè)P27KipImRNA表達(dá)的改變。 研究結(jié)果：(1)2ng／mlIGF-1對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞有輕微的增殖刺激效應(yīng)。從20ng／ml濃度開始，IGF-1能明顯刺激骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的快速增殖，更高濃度的IGF-1(50n

7、g／ml，100ng／m1)與20ng／ml的增殖刺激效應(yīng)相比無(wú)顯著差異。(2)IGF-1刺激后骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖迅速，容易因?yàn)榧?xì)胞密度過(guò)大融合形成缺乏增殖能力的多細(xì)胞核肌管細(xì)胞。因此，利用IGF-1體外擴(kuò)增骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞時(shí)應(yīng)密切觀察細(xì)胞的增殖情況，及時(shí)傳代和更換培養(yǎng)基。(3)IGF-1作用于骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞后，P13K信號(hào)通路效應(yīng)分子FOX01蛋白磷酸化水平增加，磷酸化、非磷酸化FOX01比值增加。細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)因子P27Kipl蛋白

8、出現(xiàn)下調(diào)，且P27raplmRNA的表達(dá)也出現(xiàn)明顯的下調(diào)。 研究結(jié)論：(1)20ng／ml濃度的IGF-1足以刺激骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的體外快速、大量增殖?？梢栽诙唐趦?nèi)利用數(shù)量有限的組織快速獲取大量骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞為組織工程技術(shù)治療相關(guān)疾病服務(wù)。(2)在利用IGF-1體外擴(kuò)增骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞時(shí)應(yīng)密切觀察細(xì)胞增殖狀況，避免細(xì)胞融合。(3)IGF-1可以通過(guò)P13K細(xì)胞信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖刺激效應(yīng)。在IGF-1誘導(dǎo)下，磷酸化FO

9、X01蛋白的增加和功能失活，使細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)因子P27rapl在轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)下調(diào)，進(jìn)入細(xì)胞周期增殖的障礙被解除，促使了骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的活躍增殖。 研究目的：(1)利用大鼠構(gòu)建用于實(shí)驗(yàn)研究的女性壓力性尿失禁動(dòng)物模型。(2)觀察骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞尿道周圍注射后對(duì)尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)產(chǎn)生的影響及自體骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞尿道周圍注射后局部組織形態(tài)學(xué)的改變。 研究方法：(1)實(shí)驗(yàn)分組及女性壓力性尿失禁動(dòng)物模型的建立：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用雌性SD大鼠。設(shè)

10、正常對(duì)照組(n=10)；同時(shí)建立壓力性尿失禁動(dòng)物模型20只，其中一部分作為壓力性尿失禁動(dòng)物模型組對(duì)照(n=10)；一部分在造模后第2個(gè)月末接受自體骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞尿道周圍注射治療，即細(xì)胞注射治療組(n=10)。動(dòng)物模型建立采用雙側(cè)卵巢切除+反復(fù)陰道擴(kuò)張法。(2)壓力性尿失禁動(dòng)物模型建立后第2個(gè)月末，從大鼠后肢肌肉組織分離自體骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，經(jīng)IGF-1體外擴(kuò)增達(dá)到足夠數(shù)量后，被注射到尿道周圍，注射位點(diǎn)在近段尿道后外側(cè)，使用Hamilton

11、微量注射針，每側(cè)注射細(xì)胞量為2×106個(gè)。(3)尿液控制機(jī)能評(píng)價(jià)：尿流動(dòng)力學(xué)儀測(cè)定腹壓漏尿點(diǎn)壓。細(xì)胞注射治療組接受細(xì)胞注射治療1個(gè)月后，即本實(shí)驗(yàn)開始3個(gè)月后，3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均測(cè)定腹壓漏尿點(diǎn)壓，同時(shí)切取局部尿道組織，HE染色，觀察形態(tài)學(xué)變化。 研究結(jié)果：(1)女性壓力性尿失禁動(dòng)物模型組腹壓漏尿點(diǎn)壓明顯低于正常對(duì)照組和細(xì)胞注射治療組。One-WayANOVA統(tǒng)計(jì)分析，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞注射1個(gè)月后，細(xì)

12、胞注射治療組腹壓漏尿點(diǎn)壓明顯高于壓力性尿失禁動(dòng)物模型組，但低于正常對(duì)照組。One-WayANOVA統(tǒng)計(jì)分析差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)自體骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞注射后可以使注射局部尿道壁肌層增厚、肌纖維得到增強(qiáng)。 研究結(jié)論：(1)大鼠雙側(cè)卵巢切除+反復(fù)陰道擴(kuò)張是建立女性壓力性尿失禁動(dòng)物模型的較為可靠的方法。(2)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞注射后能明顯提高壓力性尿失禁動(dòng)物模型的漏尿點(diǎn)壓，對(duì)治療壓力性尿失禁有一定的療效。注射后產(chǎn)生的充填效應(yīng)可能是腹壓漏尿