人臍血單個(gè)核細(xì)胞移植改善雌鼠壓力性尿失禁的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是一種常見(jiàn)的盆底功能障礙性疾病(pelvic floor dysfunction, PFD)，世界范圍內(nèi)約有2億人存在尿失禁問(wèn)題。SUI與盆底和尿道薄弱有關(guān)，婦女分娩時(shí)的肌肉組織、結(jié)締組織和神經(jīng)損傷可能是導(dǎo)致該疾病最重要的危險(xiǎn)因素。引起壓力性尿失禁的主要機(jī)制有尿道高活動(dòng)性和固有括約肌功能障礙(intrinsic sphincter deficiency，ISD

2、)。目前多數(shù)研究者認(rèn)為大多壓力性尿失禁患者同時(shí)有ISD和尿道高活動(dòng)性?xún)煞N因素存在，ISD在SUI的發(fā)病過(guò)程中起重要作用。
　　一位有80年壽命的女性一生中可能要承受11.1％的盆底手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，其中29％至少經(jīng)歷一次手術(shù)。15年后，這個(gè)風(fēng)險(xiǎn)相似，約12.2％，其中19％有再次手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，6.2％接受了再次手術(shù)?；诿绹?guó)的一組數(shù)據(jù)也證明，80年壽命的女性一生中可能要承受20％的盆底手術(shù)或者尿失禁手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)。尿道懸吊帶術(shù)和尿道旁填充術(shù)作為初

3、始尿失禁（urinary incontinence，UI）的外科治療方法已經(jīng)被認(rèn)可。但是，前者有30％再次手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)，后者是前者的9倍。即便手術(shù)達(dá)到85％～90％的成功率，也意味著有10％～15％的手術(shù)患者仍然持續(xù)的尿失禁，而且還有吊帶侵蝕、梗阻和感染等發(fā)生。目前治療尿失禁的方法多只能解決膀胱頸支撐功能障礙和改善尿道局部壓力，不能糾正ISD，因此長(zhǎng)期療效不理想，而且并發(fā)癥較多。
　　利用干細(xì)胞修復(fù)和增強(qiáng)受損括約肌的功能，是目前治療

4、SUI的新思路。臍血干細(xì)胞(umbilical cord blood stem cell，UCBSC)主要含有造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)可以分化為多種細(xì)胞，并且在臨床上已經(jīng)得到運(yùn)用。UCBSC免疫原性較弱，可以為異體細(xì)胞移植所用。臍血是一種非常有潛力的干細(xì)胞資源，隨著臍血庫(kù)的建立及規(guī)范化管理，臍血有望成為將來(lái)干細(xì)胞移植治療SUI的最可靠和最穩(wěn)定的細(xì)胞來(lái)源。臍血單個(gè)核細(xì)胞(human cord blood mononuclear

5、 cells，HCMNCs)含有UCBSC，是一多異質(zhì)性細(xì)胞群，能分泌多種細(xì)胞因子(cytokines，CKs)，因此，可能是一種理想的細(xì)胞移植的來(lái)源。
　　本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谘芯縃CMNCs移植至SUI大鼠近端尿道后，觀察受損尿道組織內(nèi)的細(xì)胞分布和尿道組織解剖形態(tài)學(xué)的變化，以及檢測(cè)SUI大鼠控尿能力的改變，探討移植細(xì)胞對(duì)有ISD的尿道括約肌的修復(fù)和功能重建作用。
　　本研究以Sprague-Dawley雌性大鼠為研究對(duì)象，采用

6、反復(fù)陰道擴(kuò)張的方法模擬產(chǎn)道損傷建立雌性SD大鼠SUI模型，利用密度梯度離心法分離出HCMNCs;檢測(cè)和鑒定SUI模型;培養(yǎng)并標(biāo)記HCMNCs，于SUI大鼠模型移植注射標(biāo)記的細(xì)胞，觀察移植細(xì)胞的分布及尿道組織形態(tài)的變化，以及SUI模型尿控的改變。主要實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下:
　　一、動(dòng)物分組、SUI模型建立和尿道組織解剖研究
　　40只雌鼠用于研究，分為模擬組(sham)10只和實(shí)驗(yàn)組（即陰道擴(kuò)張組，VD）30只，實(shí)驗(yàn)組包括細(xì)胞移

7、植治療組(T)15只，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(C)15只。實(shí)驗(yàn)組大鼠麻醉后，消毒會(huì)陰部，然后放置經(jīng)潤(rùn)滑的8-Fr Foley尿管入陰道內(nèi)，4/0絲線縫合固定在陰道外口，3ml生理鹽水注入氣囊，經(jīng)過(guò)2小時(shí)陰道擴(kuò)張，抽出氣囊鹽水，拔出尿管，7天后重復(fù)擴(kuò)張一次。模擬組只置入導(dǎo)尿管而不擴(kuò)張。結(jié)果:所建模型的功能檢測(cè)中噴嚏試驗(yàn)均為陽(yáng)性，并且尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)發(fā)生變化;再則，模型雌鼠陰裂變長(zhǎng)，同時(shí)尿道組織形態(tài)提示尿道括約肌受損[6]。
　　二、人臍血單個(gè)核

8、細(xì)胞分離、培養(yǎng)及標(biāo)記
　　無(wú)菌條件下取臍帶血50～100ml，6小時(shí)內(nèi)分離，采用密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞，L-DMEM培養(yǎng)，采用不同標(biāo)記物標(biāo)記，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。結(jié)果:分離的臍血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)后細(xì)胞胞體增大，呈紡錘形、梭形細(xì)胞和團(tuán)簇樣細(xì)胞。BrdU(5-溴脫氧尿核苷)及DAPI（4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚）可標(biāo)記上細(xì)胞。
　　三、HCMNCs移植及檢測(cè)移植后SUI模型尿控的改善和尿道括約肌的改變
　　1.經(jīng)DAP

9、I標(biāo)記的HCMNCs注射進(jìn)模型鼠尿道周?chē)?，取近端尿道組織切片，于激光掃描共聚焦顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM）下觀察到DAPI染色陽(yáng)性的移植細(xì)胞較均勻的分布于尿道周?chē)∪?，表明移植的HCMNCs在尿道括約肌內(nèi)存活，部分染色陽(yáng)性的細(xì)胞形態(tài)呈扁平狀，并參與到肌內(nèi)的組成。
　　2.通過(guò)染色，我們發(fā)現(xiàn)陰道擴(kuò)張后尿動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的改善與尿道括約肌組織的恢復(fù)有關(guān)。細(xì)胞移植后見(jiàn)大鼠尿道括約肌肌

10、層明顯增厚，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(C)尿道控尿能力和組織形態(tài)隨時(shí)間亦逐漸恢復(fù)，但是，與細(xì)胞移植治療組(T)比較，尿控改善略差，組織恢復(fù)較慢[6]。
　　結(jié)論:本研究成功地分離培養(yǎng)和標(biāo)記了HCMNCs，通過(guò)反復(fù)擴(kuò)張陰道模擬女性生產(chǎn)時(shí)陰道擴(kuò)張的損傷，建立了SD雌鼠壓力性尿失禁模型，證明了移植的臍血單個(gè)核細(xì)胞可在受損尿道括約肌內(nèi)存活、分布，移植HCMNCs能促使尿道括約肌得以較好的修復(fù)，壓力性尿失禁大鼠控尿能力明顯改善，為臍血干細(xì)胞移植治療壓力性