脂肪源性干細(xì)胞移植治療缺血性腦損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，更新了以往認(rèn)為神經(jīng)元不能再生的傳統(tǒng)觀點(diǎn)，使人們對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能有了一個(gè)全新的認(rèn)識(shí)，并且也為臨床對(duì)腦和脊髓外傷、以及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾患提供了一個(gè)新的有效治療途徑，但因其不易獲得且存在倫理學(xué)問題，實(shí)用性受到很大限制。脂肪來源的多能干細(xì)胞(簡(jiǎn)稱ADSCs)具有來源豐富、采集方便、體外擴(kuò)增快和自體移植等特點(diǎn)，預(yù)示了此種來源的干細(xì)胞在I臨床細(xì)胞移植治療上將具有很大的優(yōu)勢(shì)。有研究報(bào)道，脂肪干細(xì)胞可在體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣

2、細(xì)胞，移植入缺血腦組織后可通過分化為神經(jīng)元等細(xì)胞和分泌神經(jīng)保護(hù)性生物因子等途徑而達(dá)到修復(fù)作用。 目的:研究ADSCs在一定的培養(yǎng)條件下可被誘導(dǎo)成神經(jīng)干細(xì)胞并進(jìn)一步分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞，并表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記物Nestin和神經(jīng)元特異性標(biāo)記物NSE。探索使用超順磁性納米氧化鐵顆粒(SPIO)和多聚左旋賴氨酸(PLL)復(fù)合物對(duì)脂肪干細(xì)胞進(jìn)行磁性標(biāo)記和MRI用于示蹤磁性標(biāo)記ADSCs的可行性，探索腦缺血損傷后脂肪干細(xì)胞移植治療腦組織

3、損傷的作用機(jī)制。 方法:Sprague-Dawley大鼠(鼠齡2～4個(gè)月)過量麻醉處死，無菌條件下取出腹股溝脂肪組織，使用膠原酶I消化，分離、培養(yǎng)得到ADSCs，取培養(yǎng)的第三代ADSCs使用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，檢測(cè)誘導(dǎo)后的ADSCs表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物和ADSCs分化后表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物的情況；同樣取第三代ADSCs在體外使用SPIO-PLL復(fù)合物行磁性標(biāo)記，臺(tái)盼蘭拒染試驗(yàn)判斷磁性標(biāo)記對(duì)ADSCs的活性有無影響，普魯士

4、藍(lán)染色和體外MRI判斷ADSCs磁性標(biāo)記的有效性；36只缺血造模成功的Sprague-Dawley大鼠分成缺血對(duì)照組、PBS治療組和磁性標(biāo)記ADSCs治療組，每組12只。造模后3天，采用立體定向儀進(jìn)行細(xì)胞移植，移植位點(diǎn)：皮質(zhì)(前囟后3mm，旁開3mm，深4mm)，垂直距離以顱骨外板為標(biāo)準(zhǔn)。SPIO標(biāo)記組大鼠在ADSCs腦內(nèi)移植后當(dāng)天和第3周進(jìn)行磁共振動(dòng)態(tài)觀察。采用改良神經(jīng)損害嚴(yán)重程度評(píng)分(改良NSS評(píng)分)對(duì)ADSCs移植后各組動(dòng)物進(jìn)行神

5、經(jīng)系統(tǒng)行為和運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估。移植后21天處死所有大鼠取下腦組織固定行神經(jīng)元特異性稀醇化酶(NSE)、CD31免疫組化染色和普魯士藍(lán)染色。采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有顯著性。 結(jié)果: 1)由脂肪組織來源的多能干細(xì)胞可在體外培養(yǎng)并穩(wěn)定增殖，ADSCs經(jīng)免疫熒光染色，絕大多數(shù)細(xì)胞呈CD44陽性。 2)第3代的ADSCs在誘導(dǎo)培養(yǎng)基作用下可被誘導(dǎo)為神經(jīng)干

6、細(xì)胞樣生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)，神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物nestin免疫組化染色陽性，經(jīng)誘導(dǎo)分化后表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物NSE。 3)傳代至第3代的ADSCs體外行SPIO+PLL復(fù)合物標(biāo)記后進(jìn)行Prussian Blue染色，幾乎所有的磁性標(biāo)記ADSCs胞質(zhì)內(nèi)均可見多少不等的藍(lán)染鐵顆粒，標(biāo)記率為100％，而未經(jīng)PLL修飾的SPIO標(biāo)記ADSCs，僅少數(shù)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)見藍(lán)染的鐵顆粒；各時(shí)相點(diǎn)磁標(biāo)記細(xì)胞的Typan Blue拒染率與未標(biāo)記細(xì)胞間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。體

7、外MR成像時(shí)，SPIO-PLL標(biāo)記的ADSCs于T2WI上可使MR信號(hào)明顯減低。 4)將SPIO-PLL標(biāo)記和未標(biāo)記的ADSCs移植到正常的SD大鼠雙側(cè)大腦實(shí)質(zhì)中，1周后使用1.5TMR掃描儀檢查，見磁性標(biāo)記ADSCs移植處在T2WI和T2*WI序列均呈低信號(hào)改變，其中以T2*WI序列最為敏感，而未標(biāo)記ADSCs移植處未見低信號(hào)改變。 5)在ADSCs腦內(nèi)移植后進(jìn)行磁共振動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，損傷對(duì)側(cè)腦內(nèi)移植的磁性標(biāo)記ADSCs

8、可通過胼胝體遷移至缺血性腦損傷灶周圍。腦組織NSE、CD31免疫組化染色顯示部分ADSCs陽性，與MR示蹤成像上所顯示的低信號(hào)區(qū)相對(duì)應(yīng)部腦組織普魯士藍(lán)染色可見染色陽性的移植細(xì)胞。 6)NSS評(píng)分顯示ADSCs移植組大鼠神經(jīng)系統(tǒng)行為和運(yùn)動(dòng)功能改善較對(duì)照組大鼠明顯。 結(jié)論:ADSCs可在體外一定的誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)成nestin表達(dá)陽性的神經(jīng)干細(xì)胞樣生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)，且可進(jìn)一步分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞。SPIO-PLL復(fù)合物可安全有效地標(biāo)