自體骨骼肌細胞尿道周圍注射治療壓力性尿失禁的實驗研究.pdf

1、壓力性尿失禁同勃起功能障礙一樣，是一種多發(fā)、難以啟齒，且嚴重影響患者身心健康的疾病，多發(fā)生于生育后女性和前列腺術后，尋求一種簡便、安全、有效的治療方法十分重要。除了手術，尿道周圍注射是目前運用較多、效果較好的方法，常用的注射材料有特氟隆、膠原、硅有機樹脂(硅微粒和硅微球)、生物玻璃等。但這些材料注射治療遠期效果較差，且有過敏、炎癥、注射顆粒遠處轉移等并發(fā)癥。近年來，人們開始尋找更為有效的注射材料治療尿失禁。人們在對Duchenne氏肌營

2、養(yǎng)不良(DMD)的研究過程中，對骨骼肌細胞的生物學行為有了進一步的了解。骨骼肌包括有絲分裂后一些很長的被稱為肌纖維(肌原纖維)的多核細胞和單核成肌細胞(myoblast)。成肌細胞在通常情況下處于靜止狀態(tài)，肌肉損傷時能夠分裂，然后和肌原纖維融合以修復肌肉的損傷。最近Qu等又純化出一種分裂能力很強的肌細胞叫肌源細胞(musclederivedcells，MDC)，它含有衛(wèi)星細胞(musclesatellitecells)，后者具有干細胞功

3、能，在適當?shù)臈l件下可分化為骨骼肌纖維、平滑肌纖維、甚至軟骨細胞。且分化后的肌纖維為有絲分裂后的成纖維細胞(postmitoticwithmaturation)，不會無限制分裂而失控。隨著泌尿系統(tǒng)組織工程技術的發(fā)展，人們開始注意到自體MDC移植對改善尿道括約肌和膀胱的功能或許有幫助。而且下尿路功能障礙，尤其是尿失禁，病變部位局限，位置表淺，易于注射。而且自身組織材料，和其他注射材料相比，不存在組織相容性問題，亦不怕注射物遠處轉移。

4、 本研究以動物實驗的方法對大鼠，尤其是成年大鼠的MDC進行純化、培養(yǎng)及鑒定；攜帶Lac-2基因的腺病毒轉染肌源細胞；轉染后MDC的自體尿道周圍注射；壓力性尿失禁模型的制備；MDC自體尿道周圍注射對尿失禁的治療作用等進行了系統(tǒng)的研究。并取得了以下結果：(1)建立了成年大鼠MDC純化、培養(yǎng)及鑒定方法；(2)MDC自體尿道周圍注射可長期存活；(3)模擬婦女難產(chǎn)成功建立了大鼠壓力性尿失禁模型；(4)MDC自體尿道周圍注射對壓力性尿失禁有治療作用

5、。這些為MDC自體尿道周圍注射將來在臨床上的應用提供了實驗依據(jù)。 第一部分成年大鼠骨骼肌肌源細胞的純化、培養(yǎng)及鑒定 目的：建立一種成年大鼠骨骼肌肌源細胞的純化及培養(yǎng)方法。 方法：取成年雌性SD大鼠前肢肱三頭肌，用膠原酶和dispase進行消化，200目的篩網(wǎng)濾過。采用差速貼壁的方法純化骨骼肌肌源細胞：將細胞懸液置入經(jīng)鼠尾膠原包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，以細胞貼壁的快慢將肌源細胞分為PP1-PP6。在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)1小時，貼

6、壁的細胞為PP1；未貼壁的細胞懸液轉入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2小時貼壁的細胞為PP2；未貼壁的細胞懸液再轉入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)18小時，貼壁的細胞為PP3,未貼壁的細胞懸液轉入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24小時，貼壁的細胞為PP4，此過程重復(間隔24小時)至PP6。用含20％胎牛血清的HamsF10培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。α-骨骼肌肌動蛋白(α-sarcometricactin)免疫細胞化學染色對PP1-PP6的細胞進行鑒定。 結果：PP1、PP2細胞

7、貼壁迅速，細胞形態(tài)呈扁平、多突起，且胞漿極其豐富，細胞數(shù)量多，生長迅速，PP3以后的細胞數(shù)量逐漸減少，貼壁緩慢，早期細胞呈梭形或紡錘形。經(jīng)α-sarcometricactin免疫細胞化學染色，骨骼肌肌源細胞呈陽性，而成纖維細胞和平滑肌細胞均為陰性。PP1、PP2陽性率低，PP3-PP6陽性率逐漸增高，肌管為強陽性。 結論：采用差速貼壁的方法可以成功分離、純化成年鼠骨骼肌肌源細胞，為將來自體肌肌源細胞注射治療壓力性尿失禁打下了基礎

8、。 第二部分:鼠肌源細胞自體及異體移植的實驗研究 目的：探討肌源細胞(musclederivedcell，MDC)自體及異體移植能否在體內長期存活，以及在肌源性疾病治療，尤其是在壓力性尿失禁治療中的價值。方法：采用差速貼壁法分離、純化培養(yǎng)6只雌性SD大鼠的MDC，然后用攜帶Lac-Z基因的腺病毒載體轉染MDC，待轉染成功后將約5×106攜帶Lac-Z基因的MDC注射于自體(6只)和同種異體(4只)大鼠膀胱頸周圍。自體注射

9、后7和15天，異體注射后1和3天處死大鼠取出膀胱及后尿道，注射部位組織行組織學檢查及X-gal染色。 結果：自體移植后在各時間點注射部位未見明顯炎癥改變及炎性細胞浸潤，局部細胞層數(shù)增多。經(jīng)X-gal染色顯示在7天及15天均可見大量的細胞被藍染，提示移植細胞在體內成活。異體細胞移植后檢查：組織學檢查同自體移植，X-gal染色顯示在第1天可見少許細胞被藍染，第3天僅在個別視野有零星被藍染的細胞。 結論：自體MDC移植在體內可

10、獲長期存活，有可能成為治療肌源性疾病(如壓力性尿失禁、心肌梗死等)的有效方法，而異體注射在體內不能長期存活。 第三部分:模擬婦女難產(chǎn)建立大鼠壓力性尿失禁模型 目的：模擬婦女難產(chǎn)建立大鼠壓力性尿失禁模型，并對陰道長時間擴張對漏尿點壓及尿道解剖的影響進行了研究。 方法：26只成年未生產(chǎn)過的雌性SD大鼠隨機分為實驗組(22只)和對照組(4只)，實驗組陰道內置水囊擴張4h模擬難產(chǎn)。4周后，兩組均行尿流動力學檢查測膀胱最大

11、容量和漏尿點壓(LPP)及噴嚏實驗，然后，處死所有大鼠取膀胱及尿道行組織學檢查。 結果：實驗組膀胱最大容量及LPP均較對照組明顯降低，噴嚏實驗有45.5％的出現(xiàn)壓力性尿失禁(SUI)，而對照組無一例出現(xiàn)SUI。組織學檢查實驗組見尿道周圍骨骼肌及平滑肌肌層斷列、變薄，膠原組織明顯增加，對照組無明顯改變。結論：陰道長時間擴張可導致SUI，是研究SUI形成機制及治療的理想模型。 第四部分:骨骼肌肌源細胞自體移植治療壓力尿失禁的

12、實驗研究 目的：用陰道擴張的方法模擬難產(chǎn)建立壓力性尿失禁模型，探討自體骨骼肌肌源細胞(MDC)移植對壓力性尿失禁的治療作用。 方法：26只成年未生產(chǎn)過的雌性SD大鼠隨機分為實驗組(22只)和對照組(4只)，實驗組陰道內置水囊擴張4h模擬難產(chǎn)，4周后，兩組均行尿流動力學檢查測膀胱最大容量和漏尿點壓(LPP)及噴嚏實驗。對噴嚏實驗陽性的10只大鼠再分為實驗組(6只)和對照組(4只)，實驗組采用差速貼壁法分離、純化培養(yǎng)其MDC

13、，然后用攜帶Lac-Z基因的腺病毒轉染MDC，待轉染成功后將約5×106攜帶Lac-Z基因的MDC自體注射于膀胱頸及后尿道周圍，對照組則注射等量的生理鹽水。分別于注射后7d和15d再次行尿流動力學檢查測膀胱最大容量和LPP及噴嚏實驗，然后去頸處死取出膀胱及尿道，注射部位組織行組織學檢查及X-gal染色。 結果：實驗組自體MDC注射后7d和15d再次行尿流動力學檢查測膀胱最大容量和LPP。膀胱最大容量和LPP較注射前有明顯提高(p

14、＜0.05)，噴嚏實驗有兩只變?yōu)殛幮?，其余均有不同程度的改善。注射部位無明顯炎癥改變及炎性細胞浸潤，局部細胞層數(shù)增多，經(jīng)X-gal染色顯示各時間點均可見大量的細胞被藍染，提示移植細胞在體內成活。對照組膀胱最大容量和LPP有一只有輕微提高，噴嚏實驗亦有一只有改善，其余均未見明顯變化。 結論：MDC自體膀胱頸及尿道周圍注射可使膀胱最大容量和LPP較注射前有明顯提高，且MDC可在體內長期存活，提示自體MDC移植有可能成為壓力性尿失禁的