穩(wěn)定分泌抗豬瘟病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、本試驗(yàn)用純化的豬瘟病毒（CSFV）加入等體積的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑，分別制成完全佐劑抗原和不完全佐劑抗原，免疫8周齡BALB/c小鼠。五免過后，腹腔超強(qiáng)免疫一次，取小鼠的脾細(xì)胞和Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。經(jīng)自行建立的間接ELISA方法篩選和3次亞克隆，最終獲得了5株穩(wěn)定分泌抗豬瘟病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，依次命名為C7、C9、G9、G10、4E8。 經(jīng)鑒定，5株抗豬瘟病毒單抗雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清ELISA效價為1

2、：1600～1：3200．小鼠腹水單抗ELISA效價為1：51200～1：102400。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，經(jīng)過連續(xù)傳代30代和三次凍存復(fù)蘇后，部分雜交瘤細(xì)胞抗體分泌能力有輕微下降，但分泌能力并沒有消失，但仍能穩(wěn)定分泌特異性抗體。 對篩選的陽性克隆進(jìn)行特異性鑒定。交叉反應(yīng)性試驗(yàn)結(jié)果表明，制備的抗豬瘟病毒單克隆抗體C7、C9、G9、G10及4E8與CSFV均呈陽性反應(yīng)，而與FMDV、PRV、PRRSV、PCV2、PPV均不反應(yīng)，表明所

3、制備的單抗與其它抗原無交叉反應(yīng)性；特異性抗原阻斷試驗(yàn)結(jié)果表明，CSFV能特異地阻斷雜交瘤細(xì)胞上清，競爭抑制率最高可達(dá)94．30％，而用FMDV抗原和陰性血清代替阻斷試驗(yàn)中的CSFV，阻斷前后的OD值沒有明顯的變化，表明制備的單克隆抗體對豬瘟病毒具有較好的特異性。 建立了檢測豬源抗CSFV抗體間接ELISA方法，最終確定了間接ELISA的最佳工作條件：包被抗原量為9．279μg/mL，包被液為CBS （PH9．6、0．05M），包

4、被時間為37℃1h再4℃過夜，封閉物為0．5％的明膠，酶標(biāo)二抗做1：2000稀釋。 利用C7腹水單抗建立了檢測CSFV的抗原捕獲單抗介導(dǎo)雙夾心間接ELISA （AC ELISA）方法。最終確定了豬源抗CSFV高免血清的最佳包被稀釋度為1：320，腹水單抗的最佳稀釋度為1：1600。經(jīng)鑒定，該方法對CSFV的檢測靈敏度為927．88ng/mL，且具有良好的穩(wěn)定性。 利用制備的抗豬瘟病毒單克隆抗體建立了檢測豬瘟病毒抗原的間接

5、免疫熒光檢測方法。確定抗豬瘟病毒單克隆抗體和熒光抗體的最適工作濃度分別為1：1000和1：50；交叉反應(yīng)和抑制試驗(yàn)表明該方法具有較高的特異性。建立的間接免疫熒光檢測方法簡單可行、敏感特異、結(jié)果易于判斷，為快速、敏感地檢測臨床標(biāo)本中的CSFV提供了一種重要的檢測手段。 抗豬瘟病毒單克隆抗體的制備及相關(guān)檢測方法的初步建立，為快速、敏感、準(zhǔn)確檢測臨床標(biāo)本中的豬瘟病毒及其抗體提供了重要的檢測手段，同時也為進(jìn)一步研究豬瘟病毒的生物學(xué)特性及