抗TfR抗體偶聯(lián)物靶向抗瘤效應(yīng)及其雜交瘤細(xì)胞株輕鏈基因分析.pdf

1、目的：本課題設(shè)計(jì)將姜黃素作為抗腫瘤藥物在光照條件下激發(fā)成為光敏劑，通過(guò)修飾后偶聯(lián)特異性的抗TfR 抗體協(xié)同發(fā)揮雙向抗癌效應(yīng)。為了延長(zhǎng)藥物的半衰期，進(jìn)一步探索姜黃素的光學(xué)特性，比較了TfR 抗體與光敏劑聯(lián)合應(yīng)用的不同方法，檢測(cè)其偶聯(lián)效率及體外功能，探討作用機(jī)制，并據(jù)此設(shè)計(jì)制備納米化中藥光敏劑-抗TfR 單抗偶聯(lián)物，為腫瘤的多重定位顯像與靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在此基礎(chǔ)上還分析了從同一雜交瘤細(xì)胞株中擴(kuò)增出的三條輕鏈基因，為實(shí)現(xiàn)抗TfR基因工程

2、改造與基因工程抗體靶向偶聯(lián)物抗瘤效應(yīng)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.抗TfR 單抗-偶聯(lián)物的制備及其抗瘤效應(yīng)測(cè)定；
　　 2.通過(guò)IMGT和NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)分析VH和VL基因序列；
　　 3.經(jīng)由InsightⅡ軟件模擬抗TfR 單抗Fabs 段分子結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果：
　　 1.抗TfR 單抗-偶聯(lián)物的制備及其抗瘤效應(yīng)
　　 （1）普通光照對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)影響，姜黃素在電

3、鏡下能發(fā)出土黃色熒光，在燈光照射下對(duì)腫瘤細(xì)胞原有的殺傷作用增強(qiáng)，熒光顯微鏡下可見(jiàn)Cur 能被肝癌細(xì)胞內(nèi)吞；
　　 （2）化學(xué)偶聯(lián)法制備的抗TfR 單抗-姜黃素偶聯(lián)物，其抗體效價(jià)較單抗有所降低，但對(duì)HepG2 肝癌細(xì)胞的殺傷作用比姜黃素或抗TfR 單抗單獨(dú)作用時(shí)明顯增強(qiáng)，與姜黃素+單抗混合物殺傷作用類(lèi)似；
　　 （3）光敏化姜黃素-抗TfR 單抗靶向性納米粒的性質(zhì)、特征均符合納米級(jí)顆粒：
　　 1）薄膜分散法制備的

4、脂質(zhì)體包封率穩(wěn)定；
　　 2）透射電鏡顯示Cur-NP-PEG-Ab 形態(tài)穩(wěn)定，屬于納米級(jí)；
　　 3）FCM分析結(jié)果表明Cur-NP-PEG-Ab與鼠源單抗具有相似的結(jié)合率；
　　 4）FCM分析結(jié)果表明在光照條件下Cur-NP-PEG-Ab 能影響肝癌細(xì)胞的周期S 期，并促進(jìn)其凋亡；
　　 5）Cur-NP-PEG-Ab 使線(xiàn)粒體電位降低和活性氧產(chǎn)生增加。
　　 2.抗TfR 抗體基因分析

5、r>　　 在分泌抗TfR單克隆抗體的同一株雜交瘤細(xì)胞中擴(kuò)增出三條輕鏈和一條有功能的重鏈可變區(qū)基因，功能性的VH基因片段經(jīng)DNA凝膠電泳鑒定片段大小與理論值414bp相符，DNA測(cè)序顯示該基因有完整閱讀框架。得到的三條輕鏈通過(guò)IMGT和NCBI分析確認(rèn)均來(lái)自于不同的基因家族：VL-f1引物擴(kuò)增得到MOPC21骨髓瘤中的非功能內(nèi)源性輕鏈；由VL-f2引物擴(kuò)增出有功能的輕鏈基因（命名為Vκ2），屬于IGKV4-59*01家族，可變區(qū)長(zhǎng)318

6、bp，信號(hào)肽長(zhǎng)66bp；由VL-f3引物擴(kuò)增出的功能性輕鏈基因（命名為Vκ3），屬于IGKV6-17*01，可變區(qū)長(zhǎng)324bp，信號(hào)肽長(zhǎng)60bp。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道Vκ3序列與許多單抗輕鏈可變區(qū)相同，也與骨髓瘤MPC11有功能的重排等位基因完全匹配。3D分子模擬顯示根據(jù)TfR單抗可變區(qū)模擬的Fabs結(jié)構(gòu)，兩條不同輕鏈和同一重鏈偶聯(lián)制備的Fabs段都具有完整的功能域和結(jié)合凹槽。
　　 結(jié)論：本研究通過(guò)制備可生物降解的mPEG-PL

7、GA-CUR-NPs納米顆粒，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)初步研究了改造的納米粒生物學(xué)作用，獲得了有意義的研究結(jié)果，研究表明：①制備的Cur-NP-PEG-Ab納米粒符合納米級(jí)別，具有較高的載藥量和包封率；②Cur-NP-PEG-Ab與靶細(xì)胞結(jié)合率和親本鼠源性抗體與HepG2細(xì)胞結(jié)合率相近；③Cur-NP-PEG-Ab在光照下對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用明顯增強(qiáng)，提示該納米粒在完成靶向殺傷腫瘤的同時(shí)，能發(fā)揮光敏劑的效應(yīng)；④首次將Cur-NP-PEG-Ab中的姜