一株分泌豬IFN-γ單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的制備與鑒定.pdf

1、干擾素（Interferon，IFN）-γ是被發(fā)現(xiàn)最早，研究最多的細(xì)胞因子。IFN-γ除了具有抗病毒和抗腫瘤活性外，還具有上調(diào)MHCⅡ類抗原的表達(dá)、促進(jìn)抗原提呈等免疫調(diào)節(jié)活性。為了建立豬γ-干擾素的檢測方法，研究機(jī)體的免疫狀態(tài)及免疫機(jī)制，為豬傳染病的免疫學(xué)診斷提供新方法，本研究進(jìn)行了該基因的表達(dá)、純化和單克隆抗體的制備及鑒定。
　　 首先，將含有豬IFN-基因的PET-32a-PoIFN-γ和PGEX-4T-1-PoIFN-γ的

2、重組菌BL21分別培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，得到分子量約35.0KD和43.0KD的融合蛋白。在SDS-PAGE圖中，融合蛋白His-PoIFN-γ分子量為35KD大小，該融合蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。經(jīng)超聲裂解包涵體和透析復(fù)性后，獲得較純的目的蛋白，作為免疫抗原。融合蛋白GST-PoIFN-γ分子量約為43KD大小，其中GST大小為26KD。該蛋白經(jīng)GSTrapFF親和層析柱純化后，SDS-PAGE電泳顯示為單一蛋白條帶，純化效果較好

3、，作為ELISA檢測中的包被抗原，含空載體的BL21菌培養(yǎng)誘導(dǎo)，超聲裂解復(fù)性后作為篩選抗原。
　　 融合蛋白His-PoIFN-γ腹腔注射免疫8周齡BALB/C小鼠，100μg/只，加強(qiáng)免疫三天后，取免疫小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合。分別以純化的重組蛋白GST-PoIFN-γ及空載體誘導(dǎo)后裂解物為包被抗原，用間接ELISA篩選陽性克隆，經(jīng)有限稀釋法3次亞克隆后，最終獲得一株穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為B3

4、株。
　　 分別采用Dot-ELISA和Western-blot鑒定該株單抗的特異性。結(jié)果顯示B3株單抗只與His-PoIFN-γ和GST-PoIFN-γ反應(yīng)，而與空載體表達(dá)產(chǎn)物、His-ChIFN-γ、GST-ChIFN-γ、His-F及GST-E2等非相關(guān)蛋白均無交叉反應(yīng)，表明該株單抗是針對(duì)豬IFN-γ基因的特異性單抗。采用體內(nèi)誘生腹水法制備McAb腹水，單抗腹水的間接ELISA效價(jià)在1：160000以上。進(jìn)一步用鼠源抗體亞