豬瘟病毒特異性單克隆抗體的研究.pdf

1、豬瘟(Hogcholera，HC或SwineFever，SF)，也稱豬霍亂，為便于與非洲豬瘟區(qū)別，在歐洲又稱為古典豬瘟(ClassicalSwineFever，CSF)。本病仍是危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的最重要的烈性傳染病之一。多年來一直是我國(guó)豬病防治研究的首要對(duì)象。該病是由黃病毒科(TheFamilyF1aviviridae)瘟病毒屬(TheGenusPestivirus)成員之一的豬瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus，C

2、SFV；或HogCholeraVirus，HCV)引起豬的一種以高熱稽留、小血管變性引起出血、梗塞和壞死、高死亡率等為主要特征的高度接觸性傳染病。在我國(guó)，雖然應(yīng)用兔化弱毒疫苗較好地控制了豬瘟的大規(guī)模爆發(fā)流行，但自70年代末以來我國(guó)豬瘟的流行與發(fā)病特點(diǎn)發(fā)生了很大的變化，近年來我國(guó)豬瘟的發(fā)生又呈上升趨勢(shì)，臨床表現(xiàn)更為復(fù)雜，而且免疫豬群發(fā)生豬瘟越來越多。 單克隆抗體是20世紀(jì)70至80年代延生的生物高新技術(shù)，應(yīng)用免疫學(xué)的抗體產(chǎn)生機(jī)理和

3、細(xì)胞瘤雜交技術(shù)，獲得單一抗原決定簇的高度均一相應(yīng)抗體，該種抗體特異性，敏感性，一旦獲得分泌特異單抗的雜交瘤細(xì)胞系，就可獲得高度純化，高度特異、有取之不盡，用之不完，可工廠化生產(chǎn)的針對(duì)單一抗原決定簇的抗體。由于單克隆抗體高特異、高純度和高效價(jià)，在動(dòng)物病原微生物的檢測(cè)和動(dòng)物疫病的診斷和治療上，與多克隆血清相比較，具有絕對(duì)明顯的優(yōu)勢(shì)。豬瘟病毒是養(yǎng)豬業(yè)危害最大的主要疫痛的病原微生物，每年給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。要防制此疫病要對(duì)其進(jìn)行流行病學(xué)

4、調(diào)查，掌握疫病的發(fā)病的流行情況，那就要進(jìn)行這些疫病的快速準(zhǔn)確的診斷，才能進(jìn)一步做好疫病防制工作。 本試驗(yàn)研制豬瘟病毒病原微生物的特異性單克隆抗體就是要為快速診斷和治療豬瘟奠定基礎(chǔ)。 特異性單克隆抗體的研制成功必將給豬這種主要疫病的診斷和特異性治療帶來很大的進(jìn)步。 本試驗(yàn)采用純化后的豬瘟兔化弱毒病毒液免疫六周齡健康Balb/C小鼠，第一次免疫用完全福氏佐劑疫苗，第二次用不完全福氏佐劑疫苗，第三次加強(qiáng)免疫三天后采血分

5、離血清，檢測(cè)免疫效果，免疫小鼠血清抗體OD490值上升至2.65，開始融合。融合用的骨髓瘤細(xì)胞是與制備脾細(xì)胞的小鼠為同一品系的SP2/O骨髓瘤細(xì)胞。融合的所用的骨髓瘤細(xì)胞必須處于生長(zhǎng)旺盛的狀態(tài)。飼養(yǎng)細(xì)胞在細(xì)胞融合前一天制備。 可供選擇的細(xì)胞融合的方法有物理法如電融合、激光融合、化學(xué)法和生物融合法等。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)法，融合劑為分子量為1000的聚乙二醇(PEG-1000)。 融合的過程是在50ml滅菌離心管中進(jìn)行。按一定的

6、比例將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞置于離心管內(nèi)，使之充分接觸，按嚴(yán)格的劑量逐滴加入融合劑使細(xì)胞發(fā)生融合。然后加入合適的培養(yǎng)基，滴加到鋪滿飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)。第二天檢查是否污染。 當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板時(shí)，取細(xì)胞上清液，用間接ELISA進(jìn)行陽(yáng)性孔的篩選。對(duì)篩選為陽(yáng)性的細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。 陽(yáng)性細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板時(shí)，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆。經(jīng)過三次克隆后，將得到的陽(yáng)性細(xì)胞注入小鼠腹腔，半個(gè)月后收取腹水，測(cè)定效價(jià)。 經(jīng)過多次融合、篩選