一種增強基因表達的自激活GAL4-UAS系統(tǒng)表達盒的建立.pdf

1、基因?qū)胂到y(tǒng)較低的轉(zhuǎn)染效率限制了基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的治療效用，盡管病毒介導的載體系統(tǒng)可以具備相對較高的基因表達水平，但它在基因治療中插入或整合到染色體的位置是隨機的，有引起插入突變及細胞惡性轉(zhuǎn)化的潛在危險;非病毒載體系統(tǒng)的免疫原性較低，安全可靠，并適于大規(guī)模生產(chǎn)，在外源基因短暫表達中具有優(yōu)勢，并廣泛應(yīng)用于各種DNA疫苗的研制，它的不足是體內(nèi)轉(zhuǎn)導效率低，靶向性差，基因表達時間短。綜上，采用生物安全性較好的非病毒方式，如何增強外源基因表達，進而延

2、長基因治療的時間，受到人們越來越多的關(guān)注。
　　另一方面，重組蛋白表達技術(shù)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能，及篩選靶向藥物的有力工具，在基礎(chǔ)科學以及醫(yī)藥學領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。截至目前，人們已經(jīng)研究開發(fā)出多種原核和真核表達系統(tǒng)用以生產(chǎn)重組蛋白。原核表達系統(tǒng)方便，便宜、周期短，但有些蛋白折疊不好，不帶有糖基化等修飾;而哺乳動物表達系統(tǒng)——作為典型的真核表達系統(tǒng)，主要用于制備分泌的重組蛋白。相較于其他表達系統(tǒng)的宿主，它具有最出色的蛋白質(zhì)折疊和二硫

3、鍵形成能力，表達出的蛋白最接近天然蛋白，有利于蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究，但也存在著產(chǎn)量低，培養(yǎng)成本較高的劣勢。因此，人們期望發(fā)明一種簡單高效的瞬時表達系統(tǒng)，提高重組蛋白的生產(chǎn)效率。此外，在利用重組釀酒酵母呈遞外源性DNA或RNA產(chǎn)生特異性抗體和殺傷性T細胞過程中，重組DNA疫苗引起特異性免疫反應(yīng)可能較慢，產(chǎn)生特異性抗體的劑量較小。
　　Gal4/UAS系統(tǒng)是生物體中用于研究基因表達和功能的一種生物化學方法，本實驗中在CMV表達載體的基礎(chǔ)

4、上增加一種自動激活的Gal4/UAS表達盒從而增強基因表達。首先，Gal4/UAS系統(tǒng)中2個上游激活序列(2UAS)，VP64，Gal4AD和VP64-p65-Rta三種DNA激活域進行比較，表達載體pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-Gal4BD-VP64的Luciferase表達量最高，大概是陰性對照組的16倍以上;然后將2UAS替換成4UAS，構(gòu)建新的表達載體pRS426-4UAS-CMV-Luciferase-

5、T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS，此表達載體激活的報告基因Luciferase的表達量是CMV啟動表達載體的近23倍;接著在HEK293T細胞上研究了增強基因表達的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)相比于陰性對照組，由表達載體pRS426-4UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS激活的報告基因Luciferase的表達水平從轉(zhuǎn)染后第6～10天一直維持較高水平的表達，在轉(zhuǎn)染后第8天達到了峰值。還在專門