穩(wěn)定表達(dá)雞ST3GAL I的MDCK細(xì)胞系的建立.pdf

1、流感病毒通過(guò)其表面的血凝素(HA)與細(xì)胞表面唾液酸寡糖受體結(jié)合侵染宿主細(xì)胞。禽流感病毒傾向識(shí)別α-2,3連接型受體(NeuAcα-2,3-Gal)，而人流感病毒傾向識(shí)別α-2,6連接型受體(NeuAcα-2.6-Gal)。流感病毒不同毒株間在受體識(shí)別傾向性及親和能力上存在顯著差異，進(jìn)而影響其對(duì)宿主細(xì)胞的感染、增殖和擴(kuò)散能力。 H5N1和H9N2是兩種嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的禽流感病毒亞型，部分毒株在其自然進(jìn)化過(guò)程中獲得了跨宿主感染的

2、能力，具有極為重要的公共衛(wèi)生意義。雞胚培養(yǎng)系統(tǒng)是分離增殖H5N1、H9N2禽流感病毒最常用的系統(tǒng)，但有可能改變分離株已經(jīng)形成的感染和復(fù)制特性。MDCK細(xì)胞表面同時(shí)存在α-2,6和α-2,3連接型受體，成為研究流感病毒的主要細(xì)胞。目前H5N1和H9N2亞型流行株仍保持典型的NeuAcα-2,3-Gal受體結(jié)合傾向性，部分毒株雖具備在MDCK等哺乳動(dòng)物細(xì)胞上復(fù)制增殖的能力，但低受體豐度造成病毒滴度低，蝕斑形成能力弱，給進(jìn)一步深入研究乃至疫苗

3、和抗病毒藥物研制造成極大困難。提高M(jìn)DCK工程細(xì)胞系表面受體豐度，有可能改進(jìn)禽流感病毒分離株的生長(zhǎng)滴度及蝕斑形成能力。 為此，本研究克隆了雞β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶I(ST3GALI)表達(dá)框架，構(gòu)建了高效真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，通過(guò)G418抗性及綠色熒光蛋白標(biāo)記雙重篩選，獲得一株工程細(xì)胞系克隆MDCK-ST3GALI。以特異性識(shí)別α-2,3連接型受體的高麗槐黃柏甙凝集素(MAA)為抗體，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析顯

4、示，MDCK-ST3GALI細(xì)胞系中2,3連接型受體含量較親代MDCK細(xì)胞顯著提高。選取2株H5N1禽流感病毒分離株、5株H9N2禽流感病毒分離株進(jìn)行了TCID50測(cè)定和蝕斑形成能力分析，結(jié)果顯示，7株禽流感病毒在MDCK-ST3GALI細(xì)胞上測(cè)得的生長(zhǎng)滴度比在MDCK細(xì)胞上高；與MDCK細(xì)胞相比，在MDCK-ST3GALI細(xì)胞上形成的蝕斑數(shù)量更多、面積更大、形態(tài)更為清晰。 本研究結(jié)果表明，穩(wěn)定表達(dá)ST3GALI的MDCK細(xì)胞系

5、MDCK-ST3GALI通過(guò)增強(qiáng)ST3GALI催化唾液酸與乳糖以α-2,3形式連接的效力，提高了細(xì)胞表面NeuAcα-2,3-Gal受體豐度，顯著改進(jìn)了部分H5N1和H9N2亞型分離株在MDCK細(xì)胞系上的感染敏感性和復(fù)制能力。MDCK-ST3GALI細(xì)胞系不僅為禽流感病毒α-2,3連接型受體傾向性提供了重要的研究工具，對(duì)于禽流感病毒受體結(jié)合特性變異株監(jiān)測(cè)、抗禽流感病毒藥物的篩選、中和抗體的測(cè)定乃至大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)疫苗生產(chǎn)應(yīng)用，也具有廣泛應(yīng)