一種基因消除PCR技術(shù)的建立及應(yīng)用.pdf

1、基因消除PCR(Removing PCR; R-PCR)技術(shù)是一種將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)和限制性核酸內(nèi)切酶技術(shù)相結(jié)合的用以消除兩個(gè)基因群體中的非目標(biāo)基因從而獲得目標(biāo)基因的技術(shù)。與現(xiàn)有的篩選基因群體中目標(biāo)基因的方法（抑制性差減雜交，基因芯片，高通量測序）相比，該方法具有操作較為簡單，假陽性率低，成本低廉，穩(wěn)定性好，可重復(fù)性高，適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。玉米紋枯病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）引起的，在中國

2、該病已成為制約玉米產(chǎn)量的主要病害。從轉(zhuǎn)錄組水平研究紋枯病菌誘導(dǎo)后玉米體內(nèi)基因的差異表達(dá)，是從基因水平闡釋玉米對紋枯病抗性機(jī)制的有效途徑，從而為培育廣譜、高效、穩(wěn)定、持久抗病性品種提供理論基礎(chǔ)。
　　 本研究提出了基因消除PCR技術(shù)的概念，初步建立起了單基因片段水平R-PCR和多基因水平R-PCR，試圖為篩選基因群體中的目標(biāo)基因提供一種新的技術(shù)手段。同時(shí)，將R-PCR技術(shù)成功運(yùn)用到紋枯病菌誘導(dǎo)玉米差異表達(dá)基因的篩選中，為建立相關(guān)抗

3、病基因表達(dá)譜和從全基因表達(dá)水平上深入探索玉米對紋枯病的系統(tǒng)抗病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)以玉米自交系Y478和立枯絲核菌高致病性融合菌群AG-1-IA為研究對象，分別采集接種紋枯病菌6h，12h，24 h，36h，48 h，60 h和72 h的葉片，將該7個(gè)時(shí)間點(diǎn)取的葉片作為混合樣本，利用R-PCR技術(shù)篩選出該樣本相對于未受侵染的玉米葉片而言上調(diào)表達(dá)的基因，并采用熒光定量PCR技術(shù)對部分基因進(jìn)行驗(yàn)證，獲得主要結(jié)果如下：⑴以小麥小GTP結(jié)合蛋白

4、基因片段為起始材料，基本建立起了單基因片段水平的R-PCR，并驗(yàn)證了R-PCR引物的特異性，證明了R-PCR技術(shù)在原理上是可行的。⑵以玉米Y478基因組DNA為起始材料，在單基因片段水平R-PCR的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化建立起多基因水平R-PCR，并取得較好的消除效果，進(jìn)一步證明了R-PCR技術(shù)的可行性和高效性。⑶以接病的Y478 cDNA和未接病的Y478 cDNA為起始材料，采用R-PCR技術(shù)，獲得紋枯病菌誘導(dǎo)玉米上調(diào)表達(dá)基因片段的R-P

5、CR產(chǎn)物。將該R-PCR產(chǎn)物進(jìn)行群體T-A克隆，得到的122個(gè)陽性克隆經(jīng)過測序分析，獲得53條唯一的EST序列。⑷將篩選得到的53條EST序列提交到Genbank中進(jìn)行Blast比對分析，其中41條EST序列對應(yīng)基因的功能是已知的，剩余12條EST序列無基因功能注釋。對篩選到的差異表達(dá)且功能已知的基因根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行簡單的分類，發(fā)現(xiàn)其中有8個(gè)基因與抗病、防御反應(yīng)直接相關(guān)，其它33個(gè)基因在紋枯病菌與玉米互作中的作用，有待進(jìn)一步的研究。⑸對