一種用于HCV核心蛋白體外表達(dá)研究的CHO細(xì)胞模型的建立.pdf

1、目的：
　　 建立穩(wěn)定表達(dá)HCV C蛋白的CHO細(xì)胞模型,為研究HCV C蛋白與宿主細(xì)胞的相互作用,闡述HCV感染致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 1、質(zhì)粒、菌株與細(xì)胞
　　 在BamH1酶切位點(diǎn)插入全長573bp的HCV1b基因型C基因的重組質(zhì)粒pCMH6K由日本金澤醫(yī)科大學(xué)綜合醫(yī)學(xué)研究所王春福博士惠贈;感受態(tài)菌DH5α購自TaKaRa公司;CHO細(xì)胞購自中國科學(xué)

2、院上海細(xì)胞庫,生長于37℃、5％CO2及含有10％FCS的DMEM中。
　　 2、主要試劑
　　 小量質(zhì)粒提取試劑盒:Axygen公司;DMEM(Code No.SH30022.01B):ThermoFisher生物制品北京有限公司生產(chǎn);胎牛血清(CodeNo.TBD31HB):天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司生產(chǎn);氨芐青霉素、脂質(zhì)體(Lipofectamine2000)(Cat.No.11668-027)和G418:

3、Invitrogen公司;小鼠的單克隆抗體HepC cAg(C7-50)(CodeNo.sc-57800):Santa公司;FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(Code No.ZF-0312):北京中杉金橋公司;BamHI、Total RNA提取試劑(CodeNo.D9108S)和RT-PCR試劑盒(CodeNo.DRR019A):TaKaRa公司。
　　 3、引物
　　 選自HCV C區(qū)序列:5-TTA GGA TCC A

4、CG AAT CCT AAA CCT CAA A-3'為上游引物,位于HCV C區(qū)第348-366nt位點(diǎn);5’-ACT GAA TTC CCT CAT TGCCAT AGA GGG-3'為下游引物,互補(bǔ)于HCV C區(qū)第592-610nt位點(diǎn),由TaKaRa公司合成。采用RT-PCR方法檢測pCMH6K穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的不同時(shí)期CHO細(xì)胞中HCVCmRNA。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、pCMH6K轉(zhuǎn)化與鑒定
　　 將

5、重組質(zhì)粒pCMH6K轉(zhuǎn)化到感受態(tài)菌DH50α中,通過含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)篩選出陽性菌落,接種于3ml含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,225rpm、37℃振蕩培養(yǎng)過夜,參照小劑量質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒,用BamHI酶切,1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
　　 2、pCMH6K瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞及免疫熒光檢測
　　 37℃、5％CO2的條件下常規(guī)培養(yǎng)CHO細(xì)胞于6孔板中,24h細(xì)胞達(dá)到90％以上匯合,按照Lipofe

6、ctamine2000說明書瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pCMH6K于CHO細(xì)胞,24h后,0.01MPBS洗細(xì)胞3次,4％多聚甲醛固定細(xì)胞1h,0.1％Triton-100溶液打孔10min,1％BSA封閉1h,加入小鼠的單克隆抗體HepC cAg(C7-50)(0.1％BSA1:100稀釋)4℃孵育過夜,暗室中加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(0.1％BSA1:100稀釋),37℃避光孵育1h,于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照。
　　 3、pCM

7、H6K穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞獲得穩(wěn)定表達(dá)的陽性細(xì)胞株
　　 確定本實(shí)驗(yàn)最佳G418篩選濃度:800mg/L。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將pCMH6K轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,24h后用0.25％胰酶以1:4密度消化傳代,繼續(xù)培養(yǎng)24h,待細(xì)胞密度增至50-70％匯合時(shí),加入800 mg/L G418濃度篩選培養(yǎng)基加壓篩選2w,獲得具有抗生素抗性的陽性細(xì)胞克隆,半量G418(400 mg/L)維持篩選培養(yǎng)擴(kuò)大陽性克隆,繼續(xù)傳代培養(yǎng)110d以上,即得到穩(wěn)

8、定表達(dá)HCV C蛋白的陽性細(xì)胞株。
　　 4、免疫熒光檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中HCV C蛋白的表達(dá)
　　 常規(guī)培養(yǎng)pCMH6K轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞,將其消化接種至6孔板中的蓋玻片上,培養(yǎng)24h細(xì)胞密度達(dá)到80％以上時(shí),0.01MPBS液洗滌細(xì)胞3次,4％多聚甲醛固定1h,O.1％Triton-100溶液打孔10min,1％BSA封閉1h,加入一抗HepC cAg(0.1％BSA稀釋,稀釋度1:100),4℃孵育過夜,暗室中加入F

9、ITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(0.1％BSA稀釋,稀釋度1:100)37℃孵育1h,50％甘油封片,于熒光顯微境下觀察細(xì)胞并拍照。
　　 5、RT-PCR檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中HCV C基因的表達(dá)
　　 將轉(zhuǎn)染后不同時(shí)期細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別提取總RNA,以Random9為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄;以5'-TTA GGA TCC ACG AAT CCT AAA CCT CAA A-3'為上游引物和5'-ACT GAATTC CCT

10、CAT TGC CAT AGA GGG-3'為下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以小鼠的管家基因GAPDH作為內(nèi)參,PCR條件:94℃預(yù)變性2min;94℃變性30sec,55℃退火30see,72℃延伸1min,共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5min,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,確認(rèn)PCR反應(yīng)產(chǎn)物。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、pCMH6K重組質(zhì)粒的鑒定
　　 提取pCMH6K經(jīng)BamHI酶切、1％瓊脂糖凝膠電泳分析,可見

11、到約573bp的片段,與HCV1b基因型C蛋白編碼基因大小相一致。
　　 2、pCMH6K瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞以及免疫熒光檢測
　　 轉(zhuǎn)染pCMH6K的CHO細(xì)胞于24h可見較顯著的綠色熒光標(biāo)記,高倍視野可見綠色熒光標(biāo)記主要分布在胞漿,也可見于胞膜,未轉(zhuǎn)染pCMH6K的CHO細(xì)胞未見特異性綠色熒光標(biāo)記,僅見散在的無特異性綠色熒光雜質(zhì)。
　　 3、pCMH6K穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞獲得穩(wěn)定表達(dá)的陽性細(xì)胞株
　　

12、pCMH6K穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的CHO細(xì)胞于培養(yǎng)后48h加入G418,加壓篩選2w,可見單個(gè)及小細(xì)胞團(tuán)簇形成即陽性克隆出現(xiàn),維持篩選第3d、6d、12d、15d可見細(xì)胞團(tuán)簇逐漸擴(kuò)大并融合;維持篩選后第35d、40 d、45d、50d、65d、85d、90d、95d、100d、105d以及110d等不同時(shí)期的細(xì)胞,可見細(xì)胞穩(wěn)定生長,通過與同步傳代的正常CHO細(xì)胞進(jìn)行光鏡下比較,二者在細(xì)胞形態(tài)上沒有顯著區(qū)別。
　　 4、免疫熒光檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

13、細(xì)胞株中HCV C蛋白的表達(dá)
　　 與未轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞比較,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞可見較顯著綠色熒光標(biāo)記,主要分布在胞漿,也可見于胞膜,轉(zhuǎn)染效率較瞬時(shí)轉(zhuǎn)染大大提高,蛋白表達(dá)量明顯增加。
　　 5、RT-PCR檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中HCV C基因的表達(dá)
　　 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見特異性條帶,反應(yīng)產(chǎn)物大約267 bp,未轉(zhuǎn)染細(xì)胞未見特異性條帶,小鼠的管家基因GAPDH產(chǎn)物約168bp。
　　 結(jié)論：