miR-205靶向VEGFA與FGF2調(diào)控乳腺癌化療耐藥性.pdf

1、背景：
　　乳腺癌的多藥耐藥性(Multidrug Resistance, MDR)是導(dǎo)致化療失敗及復(fù)發(fā)的最主要原因。腫瘤細(xì)胞可隨誘導(dǎo)藥物、誘導(dǎo)方式、細(xì)胞分化階段及所處微環(huán)境的不同而表現(xiàn)出不同的耐藥表型。MDR是指腫瘤對(duì)一種化療藥物出現(xiàn)耐藥的同時(shí)對(duì)其他結(jié)構(gòu)和功能各異的藥物亦產(chǎn)生交叉耐藥現(xiàn)象。難以避免的化療耐藥一直是有效控制乳腺癌的關(guān)鍵瓶頸。因此深入的研究乳腺癌的耐藥機(jī)制,尋找新的耐藥相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)于有效逆轉(zhuǎn)化療耐藥,提高乳腺癌

2、的整體治療水平具有非常重要的理論意義，并且為其臨床應(yīng)用開(kāi)展提供前期基礎(chǔ)。microRNA（miRNA）是由長(zhǎng)18~24個(gè)核苷酸組成的、內(nèi)源性高度保守的非編碼單鏈RNA， miRNA發(fā)揮作用的機(jī)制是通過(guò)與靶基因的 mRNA結(jié)合進(jìn)而降解或者抑制其翻譯，不同的miRNA可以靶向調(diào)控同一靶基因，而一個(gè)miRNA在不同情況下可以調(diào)控下游不同的靶基因，其基因表達(dá)調(diào)控方式為我們更加全面地了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括腫瘤細(xì)胞的MDR均開(kāi)拓了更多的思路，對(duì)進(jìn)

3、一步認(rèn)識(shí)和理解腫瘤耐藥發(fā)生的潛在的分子機(jī)制均具有重要意義。在本文的工作中，我們主要對(duì)乳腺癌多藥耐藥相關(guān) miRNA：miR-205在乳腺癌耐藥過(guò)程中發(fā)揮的功能，明確與miR-205直接結(jié)合并受其調(diào)控的靶基因,及是否通過(guò)該靶基因影響乳腺癌的耐藥及相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行了研究與探討。
　　方法：
　　1.使用 miRNA芯片對(duì)敏感株乳腺癌細(xì)胞 MCF-7與耐藥株乳腺癌細(xì)胞MCF-7/A02中的人源miRNA表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)，篩選出在兩種

4、細(xì)胞系中表達(dá)差異最顯著的miRNA：miR-205作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的對(duì)象。
　　2.用Taqman實(shí)時(shí)定量PCR的方法在不同乳腺癌細(xì)胞及對(duì)應(yīng)耐藥細(xì)胞株中驗(yàn)證 miR-205表達(dá)與腫瘤細(xì)胞耐藥的相關(guān)性，并在其他耐藥細(xì)胞系進(jìn)一步驗(yàn)證。并且檢測(cè)新輔助化療前乳腺癌組織中 miR-205表達(dá)的情況，了解miR-205的表達(dá)與乳腺癌新輔助化療敏感性的關(guān)系。
　　3.在MCF-7/A02細(xì)胞和CALDOX細(xì)胞中用慢病毒感染方式過(guò)表達(dá)miR

5、-205，以MTT方法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)阿霉素（DOX）、紫杉醇(Taxol)、依托泊苷（VP-16）的IC50，檢測(cè)其耐藥性的變化；采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)方法，評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素、紫杉醇的敏感性；通過(guò)Annexin V/PI染色法，Caspase-3/7活性檢測(cè)以及Caspase-9檢測(cè)法等方法檢測(cè)紫杉醇對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，同時(shí)使用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的mRNA水平改變，采用Western-blotting檢測(cè)了PI3K/A

6、KT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性及相關(guān)凋亡蛋白的改變。
　　4.綜合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件得到miR-205的候選基因VEGFA和FGF2。實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)FGF2與VEGFA在MCF-7VS MCF-7/A02細(xì)胞和CAL51 VS CALDOX細(xì)胞系中的表達(dá)差異,同時(shí)ELISA法檢測(cè)四組細(xì)胞上清液中VEGFA和FGF2兩種因子的變化情況。進(jìn)一步檢測(cè)MCF-7/A02和CALDOX兩組耐藥細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miR-205后，細(xì)胞VEGFA和FGF

7、2基因的變化及上清液中兩種因子的變達(dá)改變，分析比較各細(xì)胞系中miR-205表達(dá)、VEGFA和FGF2基礎(chǔ)表達(dá)水平的相關(guān)性。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-205和VEGFA3'UTR和FGF23'UTR的靶向關(guān)系。
　　5.檢測(cè)新輔助化療前乳腺癌組織中VEGFA和FGF2表達(dá)情況，分析其表達(dá)水平與乳腺癌新輔助化療敏感性及miR-205的相關(guān)性。以MTT方法檢測(cè)過(guò)表達(dá)VEGFA和FGF2和沉默兩者后細(xì)胞對(duì)阿霉素、紫杉醇、依托泊苷的IC

8、50，檢測(cè)其藥物敏感性的變化；并進(jìn)一步檢測(cè)VEGFA和FGF2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　6.采用rescue實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VEGFA和FGF2的過(guò)表達(dá)是否可以逆轉(zhuǎn)miR-205對(duì)乳腺癌化療耐藥性抑制，以確認(rèn)VEGFA和FGF2作為miR-205下游功能性的直接靶點(diǎn)調(diào)控乳腺癌化療耐藥性：以MTT方法檢測(cè)處理后各組細(xì)胞對(duì)阿霉素、紫杉醇、依托泊苷的 IC50，檢測(cè)其耐藥性的變化；采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)方法，評(píng)價(jià)各組細(xì)胞對(duì)阿霉素、紫杉醇的敏感性；通

9、過(guò)Annexin V/PI染色法，Caspase-3/7活性檢測(cè)以及Caspase-9檢測(cè)法等方法檢測(cè)紫杉醇對(duì)各組細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，同時(shí)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白及 PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白的變化，以確認(rèn) miR-205與VEGFA和FGF2的相互作用對(duì)下游通路的影響。
　　7.采用上述方法檢測(cè)在MCF-7/A02和CALDOX耐藥細(xì)胞系應(yīng)用PI3K抑制劑后對(duì)凋亡的影響，以進(jìn)一步證明miR-205對(duì)MCF-7/A02與CALDOX細(xì)胞

10、化療敏感性的調(diào)控作用是通過(guò)影響PI3K/AKT通路活性完成的。
　　8.建立裸鼠皮下移植瘤模型。將 BALB/c裸鼠隨機(jī)分為四組，將MCF-7/A02-miR-205、MCF-7/A02-NC、CALDOX-miR-205和CALDOX-NC細(xì)胞的細(xì)胞懸液分別接種于各組裸鼠右腋皮下，約1周后，開(kāi)始每隔3天清晨用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠移植瘤最長(zhǎng)徑L和最短徑W，計(jì)算腫瘤體積并做好記錄。于d15最后一次測(cè)量腫瘤體積后，給藥DOX（1mg/kg

11、）Taxol（2.5mg/kg）每三天1次腹腔注射。開(kāi)始每隔3天測(cè)量小鼠移植瘤，計(jì)算腫瘤體積，于d45最后一次測(cè)量腫瘤體積，統(tǒng)一頸椎脫臼處死，剝離瘤塊，稱重，液氮保存?zhèn)溆谩７謩e取各組瘤組織，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)MCF-7/A02-miR-205及空白對(duì)照細(xì)胞移植瘤體中miR-205的表達(dá)及VEGFA、FGF2、bax和survivin的表達(dá)變化情況。ELISA法檢測(cè)動(dòng)物模型血液中VEGFA和FGF2的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　

12、　1.對(duì)比MCF-7細(xì)胞與MCF-7/A02細(xì)胞中miRNA芯片表達(dá)譜結(jié)果，在這兩種細(xì)胞內(nèi)共獲得19個(gè)差異表達(dá)的miRNA，結(jié)合本課題組前期血清學(xué)miRNA檢測(cè)結(jié)果，選定在耐藥細(xì)胞系中為下調(diào)表達(dá)的miR-205為進(jìn)一步的研究對(duì)象。
　　2.采用qPCR方法對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)在乳腺癌MCF-7細(xì)胞、Cal51細(xì)胞、MTMEC細(xì)胞及其對(duì)應(yīng)耐藥細(xì)胞系中，miR-205在耐藥細(xì)胞中低表達(dá)，同時(shí)在白血病K562細(xì)胞、HL60細(xì)胞、淋巴

13、瘤BJAB細(xì)胞及對(duì)應(yīng)耐藥細(xì)胞中miR-205表達(dá)量與耐藥性呈負(fù)相關(guān)性。miR-205表達(dá)量與乳腺癌患者新輔助化療療效正相關(guān)，即miR-205表達(dá)越高療效越好。
　　3.在乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/A02和CALDOX細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-205后腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性提高，同時(shí)對(duì)紫杉醇、依托泊苷的化療敏感性均有所提高；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相同化療藥物濃度下， miR-205過(guò)表達(dá)能抑制MCF-7/A02和CALDOX細(xì)胞的克

14、隆形成能力；對(duì)于由紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，過(guò)表達(dá)miR-205后乳腺癌細(xì)胞凋亡程度顯著提高；過(guò)表達(dá)miR-205后，各組細(xì)胞凋亡基因Bax mRNA表達(dá)增加，抗凋亡基因survivin mRNA表達(dá)下降；在蛋白水平的檢測(cè)中，pAKT表達(dá)下降，促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加，抗凋亡蛋白survivin表達(dá)下降。
　　4.生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示VEGFA和FGF2mRNA3'UTR和miR-205有兩處可以結(jié)合的保守序列。VEGFA和

15、FGF2在兩種耐藥細(xì)胞系中表達(dá)均高于在對(duì)照細(xì)胞中的表達(dá)，在細(xì)胞上清液中的兩種因子的表達(dá)也明顯升高。且在miR-205過(guò)表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系中，miR-205不僅可以在mRNA水平并且也可以在細(xì)胞因子水平抑制VEGFA和FGF2的表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)中，miR-205可以降低構(gòu)建的VEGFA3'UTR和FGF23'UTR野生載體的熒光活性。
　　5.分析新輔助化療前患者乳腺癌組織中miR-205和VEGFA和FGF2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)三者

16、呈負(fù)相關(guān)，并且miR-205含量越高，患者新輔助化療療效越好，而高表達(dá)VEGFA和FGF2的患者其新輔助化療療效較差。在MCF-7和CAL51細(xì)胞中加入VEGFA和FGF2因子后，直接導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥，凋亡減少，Bax的mRNA和蛋白表達(dá)均下降，而survivin mRNA和蛋白表達(dá)增多，激活PI3K/AKT通路；而外源轉(zhuǎn)入VEGFAsiRNA和FGF2 siRNA的CALDOX細(xì)胞，對(duì)阿霉素的敏感性提高。
　　6. Res

17、cue實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在miR-205穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中轉(zhuǎn)入VEGFA和FGF2后，降低耐藥細(xì)胞的化療敏感性，凋亡減少。VEGFA和FGF2過(guò)表達(dá)后，逆轉(zhuǎn)miR-205促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并且可減弱miR-205對(duì)PI3K/AKT通路的削弱作用。Bax的mRNA和蛋白表達(dá)均下降，而survivin mRNA和蛋白表達(dá)增多。
　　7.MCF-7/A02細(xì)胞給予10μM，CALDOX細(xì)胞給予2μM PI3K抑制劑LY294002處理2

18、4小時(shí)，同時(shí)添加不同濃度的紫杉醇(0.25μM VS2.5 nM)處理48小時(shí)后，Bax的mRNA和蛋白表達(dá)均增加，而survivin mRNA和蛋白表達(dá)減少。也間接提示 miR-205是通過(guò)抑制 PI3K/AKT通路活性來(lái)誘導(dǎo)凋亡而增加乳腺癌細(xì)胞化療敏感性的。
　　8.通過(guò)裸鼠皮下移植瘤模型證明過(guò)表達(dá)miR-205能顯著抑制MCF-7/A02接種后小鼠腫瘤體積的生長(zhǎng)，同時(shí)能夠提高裸鼠接受紫杉聯(lián)合蒽環(huán)類化療的敏感性。腫瘤組織中VE

19、GFA、FGF2和survivin表達(dá)減少，bax表達(dá)增多。小鼠外周血清中VEGFA和FGF2兩種因子表達(dá)下降。而CALDOX-miR-205細(xì)胞接種后的小鼠未見(jiàn)明顯成瘤。
　　結(jié)論：
　　miR-205在乳腺癌細(xì)胞及其他多種腫瘤細(xì)胞中與多藥耐藥性呈負(fù)相關(guān)。miR-205表達(dá)量與乳腺癌患者新輔助化療療效正相關(guān)，其表達(dá)越高療效越好。在乳腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá) miR-205后，腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性提高，同時(shí)對(duì)紫杉醇、依托泊苷的化

20、療敏感性均有所提高；并能促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。并且miR-205是直接通過(guò)靶向VEGFA和FGF2實(shí)現(xiàn)削弱PI3K/AKT通路活性，減少pAKT表達(dá)，增加促凋亡蛋白Bax，減少抗凋亡蛋白survivin表達(dá)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其促進(jìn)凋亡影響乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥的功能。過(guò)表達(dá) miR-205能明顯抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，并且可以通過(guò)抑制VEGFA和FGF2提高腫瘤的化療敏感性。以miR-205為治療靶點(diǎn)逆轉(zhuǎn)乳腺癌的耐藥，將為乳腺癌的治療帶來(lái)新的探索。