干預(yù)FANCF基因及BCRP基因影響人乳腺癌細(xì)胞生長及耐藥性的研究.pdf

1、BCRP(breast cancer resistant protein)與乳腺癌耐藥性關(guān)系最為密切,但調(diào)控機(jī)制不明確。范可尼貧血中。FA/BRCA通路功能缺失可激活MAPK系統(tǒng),下調(diào)BCRP表達(dá)。FANCF作為FA/BRCA通路關(guān)鍵因子調(diào)控腫瘤細(xì)胞耐藥性作用引起學(xué)者關(guān)注,但乳腺癌中未見相關(guān)報(bào)道。課題組發(fā)現(xiàn):乳腺癌細(xì)胞中FANCF基因低/失表達(dá)可干擾FA/BRCA通路生物學(xué)功能,降低BCRPmRNA表達(dá)及對阿霉素的抵抗性;但乳腺癌細(xì)胞中

2、FANCF調(diào)控BCRP表達(dá)與耐藥性是否通過MAPK系統(tǒng)尚需驗(yàn)證。為此,本研究以FANCF和BCRP同時(shí)作為切入點(diǎn),構(gòu)建FANCF基因沉默及BCRP過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞模型;在體外水平檢測不同基因特性細(xì)胞生長表型、耐藥性,分析FANCF基因沉默和BCRP過表達(dá)使FA/BRCA,MAPK通路對化療藥物絲裂霉素(MMC)誘導(dǎo)的DNA損傷的反應(yīng)性和生物學(xué)功能的異同。研究結(jié)果將為在乳腺癌藥物治療中,發(fā)現(xiàn)預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)耐藥的新切入點(diǎn)和基因靶點(diǎn),提供理論

3、與實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 應(yīng)用小提中量試劑盒提取質(zhì)粒并進(jìn)行基因測序,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF-7細(xì)胞,MDA-MB-435S細(xì)胞,RT-PCR及Westernblot檢測FANCF及BCRP基因mRNA和蛋白表達(dá)水平,確認(rèn)干預(yù)FANCF和BCRP細(xì)胞模型構(gòu)建成功;FANCF基因沉默及BCRP過表達(dá)并用絲裂霉素(MMC)作用后,分別采用MTT法、流式細(xì)胞儀JC-1染色法及FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞增殖、線粒

4、體膜電位及凋亡的改變,采用Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移及侵襲力的改變以及彗星實(shí)驗(yàn)檢測DNA損傷情況等生物學(xué)特性的變化,采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度變化。并用Westernblot檢測BCRP,FANCD2及MAPK通路相關(guān)因子的表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1.MCF-7和MDA-MB435S細(xì)胞在轉(zhuǎn)染pSliencerTM4.1CMV-FANCF-shRNA質(zhì)粒并在MMC作用24h后,陽性轉(zhuǎn)染組和陰性對照

5、組相比,在生長表型方面:細(xì)胞存活率,細(xì)胞線粒體膜電位,細(xì)胞侵襲力和遷移力顯著下降(P＜0.05),而細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞DNA斷裂損傷這顯著增加(P＜0.05),細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度顯著升高(P＜0.05)。MCF-7和MDA-MB-435S細(xì)胞在轉(zhuǎn)染pSliencerTM4.1CMV-FANCF-shRNA質(zhì)粒并在MMC作用24h后,陽性轉(zhuǎn)染組和陰性對照組相比MAPK通路相關(guān)因子(JNK,p38,c-fos,c-Jun)表達(dá)量明顯升高。BCR

6、P的表達(dá)量則明顯降低。FANCD2的表達(dá)量也明顯降低。
　　 2.與陰性對照組相比,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/BCRP質(zhì)粒后,MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-435S細(xì)胞中BCRP基因mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯升高,轉(zhuǎn)染后48h、72h,MCF-7細(xì)胞及MDA-MB-435S細(xì)胞BCRPmRNA表達(dá)率分別增加了84.23％±15.96％,132.09％±18.80％和107.80％±17.68％,182.93％±11.65％(P＜0

7、.05);WesternBlot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染后48h及72h,MCF-7細(xì)胞及MDA-MB-435S細(xì)胞BCRP蛋白表達(dá)率分別增加了65.47％±19.77％、28.42％±8.87％和17.46％±5.64％、72.71％±19.17％(P＜0.05),說明干預(yù)BCRP基因48h、72h時(shí)能顯著提高mRNA及蛋白表達(dá),BCRP過表達(dá)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MCF-7和MDA-MB-435S細(xì)胞模型成功建立。
　　 3.兩細(xì)胞在轉(zhuǎn)染pcDN

8、A3-1-BCRP-cDNA質(zhì)粒并在MMC作用24h后,陰性對照組和陽性轉(zhuǎn)染組在細(xì)胞生長表型方面:細(xì)胞存活率,細(xì)胞線粒體膜電位顯著增加(P＜0.05),細(xì)胞凋亡,細(xì)胞侵襲力和遷移力無明顯變化(P＞0.05)。而細(xì)胞DNA斷裂損傷略有降低(P＞0.05),細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度顯著降低(P＜0.05)。兩細(xì)胞間相同處理因素下,除轉(zhuǎn)染pcDNA3-1-BCRP-cDNA質(zhì)粒并用MMC處理24h后細(xì)胞存活率MCF-7較高之外(P＜0.05),其余各

9、指標(biāo)均無顯著性差異(P＞0.05)。兩細(xì)胞在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BCRP-cDNA質(zhì)粒并在MMC作用24h后,陽性轉(zhuǎn)染組和陰性對照組相比MAPK通路相關(guān)因子(JNK,p38,c-fos,c-Jun)表達(dá)量明顯降低。FANCD2的表達(dá)量變化不明顯。
　　 結(jié)論
　　 1.干預(yù)MCF-7和MDA-MB-435S細(xì)胞的FANCF基因(采用RNA干擾技術(shù)使FANCF基因沉默)可使兩細(xì)胞在IC50濃度MMC作用下和干預(yù)前相比,細(xì)

10、胞存活率顯著下降,細(xì)胞早期和晚期凋亡顯著增加,細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低,細(xì)胞侵襲力和遷移力顯著下降,細(xì)胞DNA斷裂損傷加劇,細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度升高,總之使細(xì)胞對MMC的敏感性升高;
　　 2.干預(yù)MCF-7和MDA-MB-435S細(xì)胞的FANCF基因(采用RNA干擾技術(shù)使FANCF基因沉默)可能通過上調(diào)MAPK通路相關(guān)因子(JNK,p38,c-fos,c-Jun)表達(dá),降低FANCD2的表達(dá),使BCRP表達(dá)量降低,進(jìn)而使細(xì)胞對MM

11、C的敏感性升高來降低兩種細(xì)胞對MMC的耐藥性;
　　 3.成功構(gòu)建pcDNA3.1/BCRP真核表達(dá)載體及BCRP過表達(dá)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MCF-7和MDA-MB-435S細(xì)胞模型;
　　 4.干預(yù)MCF-7和MDA-MB-435S細(xì)胞的BCRP基因(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BCRP-cDNA質(zhì)粒)可使兩細(xì)胞在IC50濃度MMC作用下和干預(yù)前相比,細(xì)胞存活率顯著升高,細(xì)胞早期和晚期凋亡減少,細(xì)胞線粒體膜電位顯著升高,細(xì)胞侵襲力和遷