miR-205在腎上腺皮質(zhì)中的調(diào)控機(jī)制初步探討.pdf

1、背景：MicroRNA(miRNA)是一種長(zhǎng)度約18-25nt的非編碼小RNA，起轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。MicroRNA一般由位于基因內(nèi)含子中的miRNA基因轉(zhuǎn)錄生成原始miRNA，在細(xì)胞核內(nèi)被RNA酶ⅢDrosha-DGCR復(fù)合體切割形成由70個(gè)核苷酸組成的前體miRNA，而后由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中前體miRNA被Dicer酶切割形成長(zhǎng)度約22nt雙鏈RNA，隨后與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)結(jié)合，形成R

2、ISC-miRNA復(fù)合體，此后一條鏈降解，另一條鏈保留在復(fù)合體內(nèi)生成為成熟的microRNA。RISC-miRNA復(fù)合體與靶基因mRNA配對(duì)，起轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用:當(dāng)miRNA與靶基因mRNA以完全或近似完全互補(bǔ)的方式結(jié)合在閱讀框時(shí)，靶基因mRNA發(fā)生特異性降解;當(dāng)miRNA與靶基因與部分互補(bǔ)的方式結(jié)合在靶基因mRNA的3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)，則抑制其翻譯，不影響其穩(wěn)定性。上述過(guò)程顯示miRNA可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控各個(gè)基因的表達(dá)，進(jìn)而

3、調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖及凋亡，參與生物體發(fā)育、代謝。研究發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)大約有1000種miRNA，調(diào)控著人體約1/3的基因表達(dá)。一種miRNA可作用于多種mRNA，多種miRNA可共同作用于一種mRNA。mRNA的3'UTR可以包含多個(gè)miRNA的作用位點(diǎn)，并且與抑制翻譯的程度有關(guān)，miRNA作用的位點(diǎn)越多，抑制的程度就越大。從而形成一個(gè)復(fù)雜而精確的網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控機(jī)體的基因表達(dá)及生理功能，當(dāng)miRNA表達(dá)水平失去平衡，就可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。miR

4、NA存在于多種組織液中，且性質(zhì)穩(wěn)定，有研究發(fā)現(xiàn)血清中含有miRNA、rRNA、mRNA等多種不同類型的小分子RNA，但主要以miRNA為主。亦有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)包括尿液、唾液、腦脊液、精液、胸腹水等多種人體體液中存在一定數(shù)量的miRNA分子。血清中miRNA能夠抵抗RNA酶的降解，在血清中非常穩(wěn)定。血清MiRNA可長(zhǎng)期放置，如室溫放置一周后miRNA僅有微量的變化，在煮沸、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿的極端條件下miRNA含量均未見(jiàn)明顯變化，此外保存多年的石

5、蠟切片組織仍可檢測(cè)到miRNA分子。正常的細(xì)胞基因穩(wěn)定有序表達(dá)，確保細(xì)胞的分裂、分化和凋亡過(guò)程協(xié)調(diào)有序進(jìn)行，而基因的異常表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限增殖、正常凋亡失控，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。目前相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)microRNA與肺癌、乳腺癌、胰腺癌、白血病等多數(shù)腫瘤相關(guān)，在這些腫瘤細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)microRNA的表達(dá)異常，但它們的具體機(jī)制并未完全研究明了。miRNA與腫瘤的關(guān)系的研究主要基于以下發(fā)現(xiàn):1.miRNA基因主要位于腫瘤相關(guān)基因組區(qū)及基因組不穩(wěn)定

6、區(qū)域;2.miRNA在正常組織細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞中表達(dá)不相同，腫瘤細(xì)胞中存在某些miRNA特異性表達(dá)增多或減少，提示MiRNA可能為腫瘤的發(fā)生創(chuàng)造條件;3.有研究發(fā)現(xiàn)某些miRNA可直接調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及凋亡。大量研究表明，miRNA與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后存在著密切的聯(lián)系。鑒于miRNA這些特點(diǎn)，使其在研究腫瘤發(fā)病機(jī)制、分子診斷以及判斷預(yù)后等方面發(fā)揮著重要的作用。腎上腺皮質(zhì)癌是一種臨床少見(jiàn)的惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的0.2％，

7、惡性程度高，侵襲能力強(qiáng)，初次診斷時(shí)常發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且復(fù)發(fā)率高。5年生存率低于30％。術(shù)前臨床診斷困難，術(shù)后腫瘤與良性腎上腺腫瘤鏡下難于鑒別。尋找更好的生物學(xué)標(biāo)志對(duì)腎上腺皮質(zhì)癌的診斷、治療、預(yù)后等顯的尤為重要。近年來(lái)對(duì)腎上腺皮質(zhì)癌基因標(biāo)志、血清學(xué)標(biāo)志及細(xì)胞學(xué)等生物學(xué)標(biāo)志進(jìn)行了大量的研究，但由于這些指標(biāo)特異性低及敏感性差，臨床應(yīng)用仍存在較多缺陷。腎上腺皮質(zhì)癌發(fā)生與發(fā)展同其他惡性腫瘤一樣，是一個(gè)包括原癌基因激活和（或）抑癌基因失活的多階段多步

8、驟的過(guò)程，而基因突變、染色體異常等基因遺傳學(xué)變化在此過(guò)程扮演著及其重要的角色，與此同時(shí)miRNA異常表達(dá)造成的原癌基因激活和（或）抑癌基因失活等表觀遺傳學(xué)的改變也發(fā)揮著重要的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA在腎上腺皮質(zhì)癌中異常表達(dá)，且在腎上腺皮質(zhì)癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中充當(dāng)著重要的角色。Ozata等人采用采用微陣列分析及qRT-PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)miR-483-3p、miR-483-5p、miR-210及miR-21在腎上腺皮質(zhì)癌組織中較

9、腎上腺腺瘤及正常組織中呈高表達(dá)，而miR-195、miR-497、miR-1974在腎上腺皮質(zhì)癌組織中較腺瘤或正常組織低表達(dá)。進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在NCL-H295R人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞中，抑制miR-483-3p及miR-483-5p的表達(dá)或增加miR-195及miR-497表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制miR-483-3p同時(shí)增加miR-195及miR-497表達(dá)則可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。我們前期通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及免疫熒光

10、技術(shù)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，腎上腺皮質(zhì)癌miR-205表達(dá)較正常腎上腺組織miR-205低，隨后研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-205的表達(dá)可以抑制人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞株SW-13的增殖。miR-205首次是在在保護(hù)小鼠及紅鰭東水純基因序列的基礎(chǔ)上，通過(guò)計(jì)算機(jī)方法被預(yù)測(cè)出來(lái)，隨后在人類體內(nèi)得到確認(rèn)。miR-205基因定位于1號(hào)染色體LOC642587位點(diǎn)第二內(nèi)含子上。在人類乳腺癌、腎癌、膀胱癌等多種腫瘤細(xì)胞中明顯低表達(dá)。由于miRNA存在多種不同的靶基因，因此

11、在不同的腫瘤中miR-205起調(diào)控作用的靶基因也不完全相同，Paolo Gandellini研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中，miR-205較正常組織表達(dá)下調(diào)，并能抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移，同時(shí)發(fā)現(xiàn)PKCε是miR-205的靶基因，miR-205通過(guò)靶向調(diào)節(jié)PKCε的表達(dá)而發(fā)揮抑制腫瘤的作用。Shahana Majid研究發(fā)現(xiàn)在腎癌細(xì)胞中，miR-205呈低表達(dá)，miR-205可以靶向抑制Src、Lyn、Yes的表達(dá)，抑制Src信號(hào)通路，從而發(fā)

12、揮抑制腫瘤的作用。本課題基于此研究背景，在人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞株SW-13中上調(diào)miR-205表達(dá)，通過(guò)預(yù)測(cè)軟件尋找miR-205新的靶基因，并進(jìn)行驗(yàn)證，以初步探討其在腎上腺皮質(zhì)癌中的作用機(jī)制。
　　 目的：⑴通過(guò)查找miRNA相關(guān)網(wǎng)站，尋找miR-205可能的靶基因；⑵在人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞株SW-13中上調(diào)miR-205的表達(dá)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析驗(yàn)證其發(fā)揮作用的靶基因；⑶檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白的變化，初步探索miR-

13、205在腎上腺皮質(zhì)癌發(fā)生、發(fā)展中可能的分子機(jī)制。
　　 方法：①通過(guò)miRNA預(yù)測(cè)相關(guān)網(wǎng)站PicTar(www.pictar.mdc-berlin)及Target Scan(www.targetscan.org)及miRSVR(www.microrna.org/microrna/home.)尋找miR-205潛在的靶基因。②通過(guò)構(gòu)建miR-205真核表達(dá)載體，進(jìn)一步轉(zhuǎn)染進(jìn)入人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞株SW-13細(xì)胞中，形成miR-205

14、上調(diào)表達(dá)的SW-13細(xì)胞（miR-205組），同時(shí)設(shè)置對(duì)照組及空白組:轉(zhuǎn)染了陰性對(duì)照的miRNA的SW-13細(xì)胞為對(duì)照組，未轉(zhuǎn)染任何試劑的SW-13細(xì)胞為空白組。③提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后行熒光實(shí)時(shí)定量PCR，分析并驗(yàn)證miR-205上調(diào)表達(dá)對(duì)其相關(guān)靶定基因表達(dá)的影響，同時(shí)提取細(xì)胞總蛋白行westernblot驗(yàn)證其蛋白表達(dá)情況。④通過(guò)western blot技術(shù)分析miR-205過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白（Bax、Caspa

15、se-3、p27、cyclingD1、pAKT、P16、caspase-9）蛋白表達(dá)水平的影響。⑤對(duì)western blot膠片進(jìn)行掃描，使用Quantity one測(cè)量各組間灰度值;用Opticon Montor軟件分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果，得出各標(biāo)本達(dá)到熒光閾值所需Ct值，采用2-△Ct計(jì)算各組基因的相對(duì)表達(dá)量(計(jì)算方法:△Ct=各組基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，基因的相對(duì)表達(dá)量=2-△Ct)。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)

16、學(xué)分析，采用ONE-WAY ANOVA檢驗(yàn)各組間有無(wú)差異，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：⑴通過(guò)miRNA預(yù)測(cè)相關(guān)網(wǎng)站PicTar(pictar.mdc-berlin)及Target Scan(www.targetscan.org)及miRSVR(www.microrna.org/microrna/home.)尋找miR-205潛在的靶基因。查找出miR-205潛在的靶基因:PCAF、E2F1、VEGF-A、Bcl-

17、2。⑵構(gòu)建了重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-miR-205，測(cè)序結(jié)果與miRbase中的序列一致，轉(zhuǎn)染進(jìn)入SW-13細(xì)胞后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示miR-205組細(xì)胞內(nèi)miR-205的表達(dá)水平較對(duì)照組及空白組升高約63.2倍(P＜0.01)，而對(duì)照組及空白組細(xì)胞miR-205表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P＞0.05)，表明重組表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-miR-205能夠在SW-13細(xì)胞中高水平表達(dá)miR-205。⑶western

18、 blot研究結(jié)果顯示，miR-205組中PCAF、E2F1、VEGF-A、Bcl-2等蛋白表達(dá)水平均低于空白組和對(duì)照組（P均＜0.05），而對(duì)照組及空白組之間表達(dá)水平無(wú)差異（P＞0.05）。⑷實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞株SW-13細(xì)胞上調(diào)miR-205的表達(dá)后，PCAF、E2F1、VEGF-A、Bcl-2表達(dá)均發(fā)生下降。與空白組及和對(duì)照組相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），而空白組與對(duì)照組相比較，各

19、基因mRNA表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。⑸western blot研究結(jié)果顯示，miR-205組中Bax、Caspase-3、Caspase-9、E-cadherin等蛋白表達(dá)水平均高于空白組和對(duì)照組（P值均＜0.05），而空白組及對(duì)照組間表達(dá)水平無(wú)差異（P均＞0.05）;同時(shí)miR-205組中cyclingD1表達(dá)下降(P＜0.05)，P27蛋白三組間表達(dá)水平無(wú)差別（P＞0.05）
　　 結(jié)論：①在人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞株S

20、W-13中，miR-205上調(diào)可以抑制Bcl-2的表達(dá)，導(dǎo)致線粒體凋亡通路下游蛋白Bax、caspase-3、caspase-9的表達(dá)增加，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)作用。②上調(diào)miR-205的表達(dá)抑制E2F1的表達(dá)，抑制cyclinD1的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控失常，細(xì)胞從G1向S轉(zhuǎn)換受阻，細(xì)胞增殖受限，腫瘤發(fā)生、發(fā)展受抑制。③上調(diào)miR-205表達(dá)后，介導(dǎo)腫瘤組織血管生成的VEGF-A從mRNA及蛋白水平均發(fā)生不同程度的減少，