miR-200b靶向ZEB2調控小細胞肺癌多藥耐藥性研究.pdf

1、研究背景:
　　 肺癌是當今世界上對人類健康危害最大的惡性腫瘤之一，全國肺癌協(xié)會最新發(fā)布的調查資料顯示我國肺癌的發(fā)病率已高居各類惡性腫瘤首位。根據腫瘤組織形態(tài)學的不同，肺癌主要分為小細胞肺癌（smallcelllungcancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-smallcelllungcancer,NSCLC，包括腺癌、鱗癌和大細胞癌），小細胞肺癌是支氣管肺癌中未分化癌分型，約占全部肺癌15％，由于較早發(fā)生血行轉移及淋巴轉

2、移，預后極差。雖然小細胞肺癌患者對化療藥物敏感，但由于極易出現多藥耐藥(multidrugresistance，MDR)而導致治療失敗，而且MDR導致的小細胞肺癌復發(fā)率很高，臨床預后差，因此，化療抗藥性已成為近年來小細胞肺癌臨床治療急需解決的重要問題之一。
　　 鋅指轉錄因子snail超家族由snail、E12/FA7、ZEB1、ZEB2及Slug五個成員組成，參與細胞分化、增殖和凋亡等重要生物過程。研究發(fā)現snail基因家族發(fā)

3、生異常表達，可導致個體發(fā)育和組織器官形成過程中出現異常形態(tài)結構，并在前列腺癌、乳腺癌、胃癌、肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，snail家族基因還參與腫瘤細胞耐藥和凋亡的調節(jié)。研究發(fā)現ZEB2在人，大鼠組織中廣泛表達，尤其是心臟，神經組織。ZEB2結合E-cad基因啟動子區(qū)的E-box序列，抑制E鈣黏蛋白、細胞角蛋白(cytokeratin)、黏蛋白，mac-1和橋粒蛋白的轉錄。這些蛋白表達的下調，尤其是E鈣黏蛋白表達的下調，對

4、于上皮間質轉化(epithelialmesenchymaltransition，EMT)起著非常重要的作用。ZEB2基因作為snail基因家族中的重要成員，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移及預后密切相關。研究發(fā)現ZEB2與膀胱癌對表皮生長因子抑制劑耐藥、卵巢癌對順鉑耐藥密切相關。然而，ZEB2基因是否參與小細胞肺癌細胞的凋亡和耐藥產生，目前尚無相關報道。
　　 MicroRNA(miRNA)是長度為19-25nt的單鏈非編碼核苷酸分

5、子，具有高度的進化保守性，通過對靶mRNA的降解或者翻譯抑制，廣泛參與動植物細胞的生長發(fā)育、分化、增殖與凋亡、激素分泌及腫瘤形成等多種重要生物過程。研究發(fā)現miRNA與腫瘤耐藥的產生也有著密切的關系。下調miRNA-200c表達，乳腺癌細胞對阿霉素的敏感性降低。在急性早幼粒細胞白血病中，miRNA-125b的高表達，可增加其對化療藥物的抗藥性。在結直腸癌中，上調miRNA-224可增加其對甲氨蝶呤的耐藥性。有研究發(fā)現非小細胞肺癌(NSC

6、LC)組織中經常發(fā)生miRNA-128b雜合性的缺失，miR-128b能夠靶向調控表皮生長因子受體，與患者對吉非替尼的敏感性及生存率有關。我們采用miRNA芯片比較分析小細胞肺癌耐藥細胞H69AR和非耐藥細胞H69中miRNAs的表達差異性，結果發(fā)現61個miRNAs出現表達異常，其中miR-375、miR-200b等24個miRNAs表達上調，而miR-100、miR-224等37個miRNAs表達下調，芯片結果得到了實時定量PCR的

7、驗證。
　　 miR-200家族包括miR-200a，miR-200b，miR-200c，miR-141，miR-429五個成員。很多研究表明，miR-200家族靶向兩個重要細胞轉錄抑制因子，即鋅指E盒子結合同源框1(ZincfingerE-box-bindinghomeobox1，ZEB1)和鋅指E盒子結合同源框2(ZincfingerE-box-bindinghomeobox2，ZEB2)，調節(jié)上皮間質轉化（Epitheli

8、al-mesenchymaltransitions，EMT）及間質上皮轉化（mesenchymal-epithelialtransitions，MET），從而影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移、耐藥等生物學行為。miR-200b是重要成員之一，生物信息學軟件分析發(fā)現miR-200b的靶基因多達7000多個。Christoffersen通過原位雜交技術，檢測到大鼠大腦中miR-200b與ZEB2mRNA共同表達，上調miR-200b后ZEB2在mR

9、NA水平和蛋白質水平都下降。
　　 我們前期采用基因芯片技術分析ZEB2基因在SCLC多藥耐藥細胞株H69AR中明顯高表達，為進一步明確ZEB2與小細胞肺癌耐藥的關系，本實驗設想通過RNA干擾技術降低小細胞肺癌細胞多藥耐藥株H69AR細胞中ZEB2表達，檢測轉染前后ZEB2在mRNA及蛋白水平的變化，通過采用細胞計數試劑盒-8(cellcountingkit-8，CCK8)法及流式細胞術分析ADM、DDP和VP-16作用H69A

10、R細胞藥物敏感性變化及凋亡和周期的變化。對小細胞肺癌組織標本進行分析，明確ZEB2的表達與患者臨床病理特征及預后的關系。
　　 我們通過生物信息學軟件（miRanda和Targetscan軟件）預測發(fā)現ZEB2是miR-200b其中一個靶基因，miR-200b位于染色體2q22.3的ZEB2簇中間，miR-200b能與ZEB2mRNA的3'-UTR部分配對，因而影響其轉錄后的翻譯過程。前期miRNA芯片顯示H69AR中miR-2

11、00b在H69AR中明顯低表達，與ZEB2的表達呈反向表達關系，提示miR-200b對ZEB2的可能具有靶向調控，本研究還將進一步確定miR-200b與ZEB2基因的調控關系。
　　 研究目的:
　　 比較SCLC多藥耐藥細胞株(H69AR)和敏感細胞株(H69)中基因表達差異，選取ZEB2基因家族中表達差異顯著的成員進行研究，分析其對SCLC耐藥性的調控作用，以及miR-200b對ZEB2基因的調節(jié)作用，進一步豐富SC

12、LC多藥耐藥性的分子機制，為臨床治療提供理論依據。
　　 內容與方法:
　　 一、ZEB2表達對小細胞肺癌多藥耐藥性的影響
　　 采用SiRNA降低H69AR細胞中ZEB2表達，CCK8法分析細胞對小細胞常用化療藥物順鉑(Cisplatin，DDP)、足葉乙甙(Etoposide，VP-16)及阿霉素(Doxorubicin，ADM)敏感性變化，流式細胞術分析細胞凋亡率及細胞周期變化。
　　 二、miR-

13、200b對ZEB2的靶向調節(jié)作用
　　 1、將miR-200b模擬物(mimic)增加H69AR中miR-200b表達水平，實時熒光定量PCR分析miR-200b及ZEB2mRNA水平，WesternBlot檢測ZEB2蛋白水平的變化。
　　 2、構建ZEB23'-非翻譯區(qū)(3'-untranslatedregion，3'-UTR)的psiCHECK-2載體(psiCHECK-2-ZEB2-3'UTR)，與miR-200

14、bmimic和inhibitor共轉染入H69AR細胞，采用雙熒光素酶報告基因測定方法檢測ZEB2熒光素酶活性。
　　 三、miR-200b對SCLC多藥耐藥性的影響
　　 采用miR-200bmimic增加H69AR、中miR-200b的表達，CCK8法分析細胞藥物敏感性的變化，確定miR-200b對SCLC耐藥性的影響。
　　 四、ZEB2在SCLC組織中的表達及臨床病理意義
　　 收集68例SCLC

15、患者石蠟包埋組織，免疫組化染色，分析ZEB2表達與SCLC患者臨床特征及生存率的關系。
　　 五、統(tǒng)計學分析
　　 所有結果均經SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。各實驗至少獨立重復3次，重復性好。所選圖表為3次重復實驗的結果之一。所有數據以均數±標準差（-x±s）表示，實時定量PCR、westernblotting、凋亡及周期實驗、熒光素酶活性測定實驗采用one-wayANOVA（方差齊時）或近似F檢驗Welch法（方差

16、不齊）;組間兩兩比較采用LSD法（方差齊時）或Dunnett'sT3法（方差不齊）。CCK8采用兩因素析因設計的方差分析，多重比較用SNK法。同一組內不同濃度間比較和同一濃度不同組間比較用one-wayANOVA。參數比較前均先進行方差齊性檢驗，若方差不齊用基于方差不齊的近似F檢驗Welch法。ZEB2表達與臨床病理特征的關系分析采用Fisher's精確分析。ZEB2表達與生存率的關系采用Kaplain-Meier分析。以P＜0.05表

17、示差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 一、下調ZEB2的表達顯著增加H69AR細胞的藥物敏感性
　　 1、ZEB2明顯降低ZEB2在H69AR細胞中的表達
　　 設計合成了三對針對ZEB2的siRNA寡核苷酸，采用lipofectamin2000轉染H69AR細胞。三組間mRNA和蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義，ZEB2-642組mRNA和蛋白水平較其它兩組明顯降低(P＜0.001)。因此選擇ZEB2-64

18、2進行后續(xù)實驗。
　　 2、CCK-8法分析結果顯示，轉染ZEB2-642的H69AR細胞對藥物的生存率較陰性對照(negativecontrol，NC)組和空白對照組明顯降低（P＜0.001），IC50值亦顯著降低。
　　 3、流式細胞術分析結果顯示，ADM、DDP和VP-16處理后，轉染ZEB2-642的H69AR細胞的凋亡率較陰性對照組和空白對照組升高，細胞周期發(fā)生改變。
　　 二、ZEB2是miR-200

19、b的靶基因
　　 1、miRNA靶基因預測軟件(PicTar,TarScan和miRBase)分析顯示，miR-200b與ZEB23'-UTR具有互補結合位點。
　　 2、miR-200b對ZEB2蛋白表達的調節(jié)作用
　　 將miR-200bmimic轉染H69細胞后，miR-200b表達增加(P＜0.001)，ZEB2蛋白水平降低(P＜0.001)，ZEB2mRNA水平無明顯變化。
　　 3、ZEB2是

20、miR-200b的靶基因
　　 (1)成功構建psiCHECK-2-ZEB2-YUTR-R載體
　　 通過PCR擴增ZEB23'-UTR，產物長度為1512bp，經轉化、抗性篩選、挑取單克隆等步驟后試劑盒提取質粒，Not(I)和Xho(I)雙酶切，產物大小約為6273bp/1512bp。酶切鑒定psiCHECK-2-ZEB2-YUTR克隆1-4和psiCHECK-2-ZEB2-YUTR-R克隆3正確，挑起psiCHECK

21、-2-ZEB2-YUTR-1號克隆和psiCHECK-2-ZEB2-3'UTR-R-3號克隆進行測序。測序結果與理論序列一致，試劑盒提取質粒進行后續(xù)實驗。
　　 (2)ZEB2熒光素酶活性受miR-200bmimic和inhibitor調節(jié)
　　 將psiCHECK-2-ZEB2-3'UTR-R或psiCHECK-2-ZEB2-3'UTR-mut載體轉染入H69AR細胞，共轉染miR-200b或inhibitor，檢測Z

22、EB2熒光素酶活性發(fā)現，與miR-NC組相比，miR-200b可顯著抑制轉染ZEB23'-UTR的H69AR細胞中ZEB2熒光素酶活性（P＜0.001），miR-200binhibitor可顯著增加轉染ZEB2的H69AR細胞中ZEB2熒光素酶活性(P＜0.001)。miR-200b和miR-200binhibitor對轉染ZEB23'UTR-mut的H69AR細胞中ZEB2熒光素酶活性無影響。
　　 三、增加miR-200b表

23、達能降低H69AR細胞對ADM、DDP和VP-16的耐藥性
　　 轉染miR-200bmimic的H69AR細胞對藥物的敏感性較陰性對照組和空白對照組增加(P＜0.001)，IC50值亦降低。
　　 四、ZEB2在SCLC組織中的表達與臨床病理特征的關系
　　 ZEB2陽性表達位于胞核，在SCLC組織中陽性表達率為23.5％(16/68)，ZEB2陽性表達率在性別、年齡及生存狀態(tài)比較無統(tǒng)計學差異(P=0.492，

24、0.776，0.098)。ZEB2在局限期(LD)患者中的陽性表達率為(7.6％)低于廣泛期(ED)患者(80.0％)，兩者的ZEB2陽性表達率具有統(tǒng)計學差異(P＜0.001)。
　　 五、SCLC患者生存分析
　　 Kaplan-Meier法分析患者生存率，結果發(fā)現男性患者與女性患者的生存率無統(tǒng)計學差異（P=0.152）。不超過57歲的患者與高于57歲以上患者生存率無統(tǒng)計學差異（P=0.097）。局限期患者的生存率高于

25、廣泛期患者，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.001)。ZEB2陰性患者的生存率高于ZEB2陽性患者，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.001)。
　　 結論:
　　 1、ZEB2在SCLC多藥耐藥株H69AR中表達增加，下調ZEB2能夠降低H69AR細胞對ADM、DDP、VP-16等化療藥物的耐藥性，表明ZEB2參與了SCLC的多藥耐藥。
　　 2、miR-200b在SCLC多藥耐藥株H69AR中表達降低，通過ZEB23'-UTR